2018年10月份陳列平教授在 Cell 上發(fā)表了一篇題為A Paradigm Shift in Cancer Immunotherapy： From Enhancement to Normalization的綜述，提出并強(qiáng)調(diào)了“免疫正常化”的概念。

文章指出，近年來(lái)，腫瘤免疫治療經(jīng)歷了一個(gè)范式轉(zhuǎn)變，從系統(tǒng)性提高免疫反應(yīng)活性的免疫增強(qiáng)（immune enhancement）轉(zhuǎn)變到選擇性糾正腫瘤微環(huán)境中免疫缺陷的免疫正常化（immune normalization）。免疫正常化的概念強(qiáng)調(diào)了在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中識(shí)別免疫反應(yīng)的特定缺陷或功能異常的重要性，并制定特定策略糾正這些缺陷，以恢復(fù)體內(nèi)正常的抗腫瘤免疫能力。免疫正常化通過(guò)解除受阻斷的免疫反應(yīng)來(lái)增加體內(nèi)抗腫瘤反應(yīng)，而免疫增強(qiáng)的目的是激活免疫系統(tǒng)來(lái)提高抗腫瘤反應(yīng)。我們可以將免疫反應(yīng)過(guò)程看作是一條有水流的管道。在這種情況下，正常的免疫反應(yīng)就是管道有正常通暢的水流。如果管道堵塞，水流將受到影響，管道將無(wú)法充分排水。在這種情況下，“增強(qiáng)”策略可以解釋為增加管道內(nèi)壓力，以克服排水不足，但如果管內(nèi)壓力增加太多，則會(huì)有破壞管道的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)。相反，“正常化”策略則會(huì)通過(guò)識(shí)別并解除阻塞以恢復(fù)正常引流，且不會(huì)危及管壁（圖1）。

那如何識(shí)別找到“水流中的阻塞”，即免疫正常化策略中的靶標(biāo)呢？

陳列平教授提出了三點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)：（1）該靶標(biāo)是由于腫瘤的生長(zhǎng)和/或隨后的免疫監(jiān)視而誘導(dǎo)的；（2）其在腫瘤微環(huán)境中選擇性高表達(dá)而正常組織中有較低的表達(dá)量；（3）其能夠引起免疫逃避，并且操縱其可以重置或重編程腫瘤微環(huán)境中的抗腫瘤免疫。有了這些特點(diǎn)，腫瘤免疫療法可以避免過(guò)度的自身免疫毒性而取得相當(dāng)大的治療效果。陳列平教授團(tuán)隊(duì)使用這一嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)鑒定新的免疫調(diào)節(jié)分子，特別是在B7-H1（PD-L1）陰性的腫瘤中，找到了不少免疫治療新靶標(biāo)。2018年12月，其團(tuán)隊(duì)就曾在Cell上發(fā)表題為Fibrinogen-like Protein 1 Is a Major Immune Inhibitory Ligand of LAG-3的論文，證明了纖維介素蛋白1(Fibrinogen-like protein 1， FGL1)是LAG-3的一個(gè)重要的功能性配體，并揭示了該LAG-3-FGL1通路在腫瘤免疫中的作用（詳見(jiàn)BioArt：Cell亮點(diǎn)丨陳列平團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫逃逸新通路）。

2019年3月4，耶魯大學(xué)陳列平教授團(tuán)隊(duì)（第一作者為王俊博士）在Nature Medicine上發(fā)表題為Siglec-15 as an immune suppressor and potential target for normalization cancer immunotherapy的文章，鑒定并證明了又一個(gè)分子——Siglec-15是一免疫抑制分子，并可作為正常化免疫治療的潛在靶標(biāo)。

該團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一個(gè)高通量功能篩選系統(tǒng)（genome-scale T cell activity array， TCAA），以在體外識(shí)別調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性的細(xì)胞表面分子（圖2）。

TCAA包含超過(guò)6500個(gè)人類基因，編碼人類基因組中超過(guò)90%的跨膜蛋白，單個(gè)基因在陣列中短暫表達(dá)。他們?cè)O(shè)計(jì)了一種基于293T細(xì)胞的人工抗原呈遞細(xì)胞系（aAPC），該細(xì)胞系表達(dá)一種用于T細(xì)胞受體激活的膜相關(guān)抗人CD3（OKT3）單鏈可變片段（scFv），以及一些跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因（DAP10、DAP12、FCER1G和CD3Z）以促進(jìn)膜蛋白表達(dá)【1】。研究者使用Jurkat T細(xì)胞來(lái)檢測(cè)靶基因的功能及其對(duì)T細(xì)胞活性的影響，Jurkat T細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)了一個(gè)由NF-κB或NFAT反應(yīng)元件驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白（green fluorescence protein， GFP）報(bào)告基因。這樣通過(guò)與空白對(duì)照組對(duì)比，就可以利用GFP信號(hào)強(qiáng)弱來(lái)鑒定aAPC上表達(dá)的膜蛋白對(duì)T細(xì)胞活性的影響。持續(xù)抑制或增強(qiáng)GFP信號(hào)的基因在多輪TCAA篩選后被選擇，隨后在體內(nèi)和體外進(jìn)行綜合分析。在這些候選基因中，一些是已經(jīng)被報(bào)道的共刺激分子（B7-1， B7-2， CD200， CD70），凋亡相關(guān)基因（FASL， TRAIL， GZMB）或共抑制分子（KLRD1， BTN3A3等等），這也驗(yàn)證了TCAA系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。

通過(guò)TCAA系統(tǒng)篩選，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)Siglec-15可持續(xù)地抑制T細(xì)胞活性，并有可能滿足正常化免疫治療的主要特征【2】，因此被選擇以進(jìn)行后續(xù)研究。Siglec-15是一個(gè)唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素家族（Siglec family）基因，編碼一個(gè)非常短的胞外結(jié)構(gòu)域（ECD）【3】。蛋白質(zhì)序列分析顯示，Siglec-15 ECD包含一個(gè)免疫球蛋白可變區(qū)（IgV）和一個(gè)2型恒定區(qū)（IgC2），與B7基因家族具有30%以上的相似性。這些數(shù)據(jù)表明，Siglec-15與B7基因家族關(guān)系密切，可能與B7家族成員共享免疫調(diào)節(jié)功能。

隨后研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)正常人體組織和各種免疫細(xì)胞亞群中Siglec-15mRNA的表達(dá)很少，但可以在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)Siglec-15在小鼠CD11b + F4/80 +外周巨噬細(xì)胞，新鮮骨髓來(lái)源的CD11b + Gr-1 +髓系細(xì)胞和骨髓來(lái)源的CD11b + F4/80 +巨噬細(xì)胞（BMDMs）中有低水平的表達(dá)量，但在其他淋巴細(xì)胞和髓系細(xì)胞亞群中未檢測(cè)到其表達(dá)。利用Siglec-15全身基因敲除小鼠以及在巨噬細(xì)胞中條件性敲除Siglec-15小鼠模型，研究人員發(fā)現(xiàn)Siglec-15基因敲出并不會(huì)導(dǎo)致小鼠自身免疫疾病或其他癥狀，之后進(jìn)行一系列體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，證明了巨噬細(xì)胞/髓系來(lái)源的Siglec-15可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)抑制抗原特異性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

然后，通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的Meta分析，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在人多種腫瘤中，Siglec-15mRNA表達(dá)量都上調(diào)。在241個(gè)人非小細(xì)胞肺癌NSCLC樣本中，通過(guò)免疫組化分析，研究人員發(fā)現(xiàn)Siglec-15可以在腫瘤相關(guān)的基質(zhì)細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，以及腫瘤浸潤(rùn)的巨噬/髓系細(xì)胞上檢測(cè)到。同時(shí)發(fā)現(xiàn)B7-H1（PD-L1）和Siglec-15表達(dá)之間沒(méi)有相關(guān)性（r=0.035，p=0.60），只有7/218（3.2%）的病例兩個(gè)標(biāo)志物均為陽(yáng)性。

最后，研究人員利用小鼠腫瘤模型進(jìn)一步證明了Siglec-15是腫瘤免疫治療正常化策略的潛在候選者。研究人員將B16-GMCSF腫瘤細(xì)胞接種到Siglec-15基因敲除小鼠體內(nèi)，與野生型小鼠相比腫瘤生長(zhǎng)緩慢，基因敲除小鼠生存期延長(zhǎng)，同時(shí)基因敲除小鼠腫瘤中CD8+T細(xì)胞，NK細(xì)胞的浸潤(rùn)也增多。此外，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了抗Siglec-15單克隆抗體α-S15，將其用在多種小鼠腫瘤模型，發(fā)現(xiàn)其的確可以阻斷巨噬/髓系細(xì)胞來(lái)源的Siglec-15的免疫抑制作用來(lái)提高體內(nèi)抗腫瘤免疫反應(yīng)。

總之，本文鑒定并證明了Siglec-15是一免疫抑制分子，并可作為腫瘤免疫治療正常化策略的潛在候選者。值得一提的是，文章也表明，目前測(cè)試人源化Siglec-15單克隆抗體（NC318）對(duì)人實(shí)體腫瘤影響的一期臨床試驗(yàn)（NC03665285）正在進(jìn)行。

為了詳細(xì)了解該工作的重要意義以及后續(xù)臨床相關(guān)信息，BioArt獨(dú)家聯(lián)系了陳列平教授。針對(duì)該項(xiàng)研究，陳教授簡(jiǎn)要總結(jié)了該發(fā)現(xiàn)以及意義。他表示：

“Siglec-15是一新的免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，在腫瘤微環(huán)境能抑制免疫反應(yīng)。Siglec-15在腫瘤微環(huán)境中的M2型巨噬細(xì)胞以及在包括肺癌、卵巢癌和頭頸癌等在內(nèi)多種人體腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)與B7-H1（PD-L1）是互斥的。實(shí)驗(yàn)證明，Siglec-15在體外和體內(nèi)都能抑制抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)。Siglec-15是B7-H1（PD-L1）陰性腫瘤（抗PD治療對(duì)其無(wú)效）中的主要免疫抑制因子。我們希望Siglec-15會(huì)是一系列免疫治療新靶點(diǎn)中的第一個(gè)，來(lái)幫助那些對(duì)當(dāng)前免疫治療無(wú)反應(yīng)的腫瘤患者。我們研究表明，Siglec-15敲除小鼠沒(méi)有發(fā)生自身免疫病或其他疾病，這表明，Siglec-15的阻斷在正常細(xì)胞上并不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。NC318，是第一個(gè)阻斷Siglec-15免疫抑制性的新藥，對(duì)NC318的1/2期臨床試驗(yàn)也正在進(jìn)行。”(生物谷Bioon.com）

小編推薦會(huì)議 2019（第十屆）細(xì)胞治療國(guó)際研討會(huì)

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