利用經過基因改造后表達嵌合抗原受體（CAR）的T細胞（CAR-T）進行過繼性T細胞治療已在B細胞惡性腫瘤中取得了臨床成功。然而，在實體瘤患者中，CAR-T細胞療法遭遇挑戰，并不那么有效。一個關鍵的障礙是允許高效根除腫瘤的癌癥特異性高表達和較低脫靶毒性（off-tumor/on-target toxicity ）風險的細胞表面靶標在數量上的有限性。

科學家們近期已報道了緊密連接蛋白6（claudin 6, CLDN6）的癌癥相關表達。CLDN6是一種參與緊密連接（tight junction）形成的四跨膜蛋白。 在一項新的研究中，為了評估CLDN6是否可作為CAR-T細胞療法的靶標，來自德國生物制藥新技術公司（Biopharmaceutical New Technologies Corporation, BioNTech）的研究人員在一套完整的人類和小鼠組織中分析了它的表達。分析結果表明在人類中，CLDN6轉錄本水平在胎兒胃部、肺部和腎臟組織中較高，但在正常的成年人組織樣本中檢測不到。此外，與之前相一致的是，CLDN6轉錄本水平在諸如睪丸癌、卵巢癌、宮頸腺癌和肺腺癌之類的多種人類癌癥中通常較高。而在小鼠中，CLDN6在胎兒器官中廣泛表達，但在產前發生下調，從而導致它在成年小鼠的大多數器官中缺乏表達。這就表明CLDN6是一種嚴格意義上的癌胚細胞表面抗原，具有適合于CAR-T細胞靶向的理想表達譜。相關研究結果近期發表在Science期刊上，論文標題為“An RNA vaccine drives expansion and efficacy of claudin-CAR-T cells against solid tumors”。

圖片來自Science, 2020, doi:10.1126/science.aay5967。 
這些研究人員設計出具有4-1BB共刺激結構域的CLDN6-CAR（即識別并結合CLDN6的CAR）。針對這種受體結構域，他們設計出一種單鏈可變區片段（scFv），這種scFv在納米摩爾范圍內對CLDN6具有高度的特異性和結合親和力。他們發現經過基因改造后表達CLDN6-CAR的T細胞（CLDN6-CAR-T細胞）可高度靈敏地識別和殺死經過CLDN6 RNA轉染的CLDN6陰性人肺癌細胞系COLO699N。此外，CLDN6-CAR-T細胞僅能殺死經過CLDN6 RNA轉染的COLO699N細胞，但不能殺死與CLDN6存在較高氨基酸同源關系的CLDN3、CLDN4或CLDN9 RNA轉染的COLO699N細胞。

當CLDN6-CAR-T細胞與CLDN6陽性人腫瘤細胞系共同培養時，他們觀察到干擾素γ（IFNγ）分泌和T細胞活化標志物上調，但是當與CLDN6陰性腫瘤細胞共同培養時，這種情形不會發生。CLDN6-CAR-T細胞也能夠高效地清除CLDN6陽性PA-1卵巢癌球狀體。通過CRISPR/Cas9敲除CLDN6可完全廢除CLDN6-CAR-T細胞對PA-1卵巢癌球狀體的識別，這進一步證實了CLDN6-CAR-T細胞的高效力和靶標特異性。

接下來，這些研究人員研究了CLDN6-CAR-T細胞在皮下異種移植人腫瘤細胞系的NSG小鼠體內的抗腫瘤活性。這些小鼠接受單劑量人CLDN6-CAR-T細胞或對照細胞移植。相比于疾病快速進展的對照組小鼠，所有接受CLDN6-CAR-T細胞治療的小鼠在2周內經歷腫瘤完全消退。在注射后25天內，循環CLDN6-CAR-T細胞仍然能夠在接受治療的小鼠體內檢測到。

為了評估這種方法是否具有更廣泛的適用性，這些研究人員選擇了與CLDN6具有較遠的親緣關系的CLDN18.2。CLDN18.2在多種具有較高醫療需求的腫瘤（比如胃食管癌和胰腺癌）中表達。在人類和小鼠中，它在正常組織中的表達局限于胃粘膜分化細胞的緊密連接處。他們通過用CLDN18.2特異性的scFv替換CLDN6特異性的scFv，構建出CLDN18.2-CAR和表達CLDN18.2-CAR的CAR-T細胞（簡稱為CLDN18.2-CAR-T）。CLDN18.2-CAR-T細胞表現出與CLDN6-CAR-T細胞相類似的功能特征。

移植的CAR-T細胞在體內的定植和持續存在是它們發揮臨床療效的關鍵。然而，就實體瘤而言，CAR-T細胞很難接觸到它的腫瘤細胞，而且在免疫抑制腫瘤微環境中，CAR-T細胞接觸靶細胞時缺乏增殖信號，因此CAR-T細胞所占的比例下降較快。

近年來，這些研究人員通過靜脈注射攜帶抗原編碼RNA的脂質體（liposomal antigen-encoding RNA, RNA-LPX）來刺激癌癥患者的天然細胞庫中的腫瘤相關T細胞。這種納米顆粒疫苗將抗原遞送到脾臟、淋巴結和骨髓中的抗原呈遞細胞（APC），同時啟動依賴于Toll樣受體（TLR）的I型IFN驅動的免疫激活程序，從而促進抗原特異性T細胞的活化和強勁增殖。

為了驗證這種方法經改進后是否可作為CAR-T細胞增強性RNA疫苗（CAR-T cell Amplifying RNA Vaccine, 簡稱CARVac）發揮作用，這些研究人員開展了一系列實驗。首先，他們測試了CLDN6 是否在樹突細胞表面上展示以便在體外刺激CLDN6-CAR-T細胞。他們檢測到經過不同劑量的編碼CLDN6 的RNA-LPX（簡稱CLDN6-LPX）處理的樹突細胞表面上CLDN6的劑量依賴性表達。由此導致的樹突細胞表面上的CLDN6表達以一種劑量依賴性的方式誘導了與樹突細胞共同培養的CLDN6-CAR-T細胞的激活、細胞因子分泌和增殖。在給BALB/c小鼠靜脈注射CLDN6-LPX后，CLDN6表達可在脾臟樹突細胞和巨噬細胞表面上檢測到，但在淋巴細胞表面上并未檢測到，這就證實CLDN6在體內唯一地遞送給抗原呈遞細胞（比如樹突細胞和巨噬細胞）。抗原呈遞細胞經歷成熟，而且在靜脈注射CLDN6-LPX的小鼠的脾臟和淋巴結中檢測到自然殺傷細胞（NK細胞）、B細胞和T細胞受到較強的激活。 

接著，C57BL/6小鼠接受經過細胞增殖染料標記的CLDN6-CAR-T細胞移植，并接種CLDN6-LPX或對照RNA-LPX。相比于接種對照RNA-LPX的小鼠，來自接種CLDN6-LPX的小鼠的所有主要身體部位的脾臟和淋巴結顯示增殖的CLDN6-CAR-T細胞比例顯著增加，這表明CLDN6抗原在淋巴區室中發生廣泛的功能性表達。

為了評估CARVac策略在體內的表現，這些研究人員讓事先接受全身照射的小鼠接受CLDN6-CAR-T細胞移植。他們發現靜脈注射單劑量CLDN6-LPX可導致循環CLDN6-CAR-T細胞顯著增殖。這種增殖與CLDN6-LPX劑量水平相關。CLDN6-CAR-T細胞比例在接種CLDN6-LPX的3到4天后達到最高峰，隨后發生下降。

在另一項實驗中，多組小鼠接受不同劑量水平的CLDN6-CAR-T細胞注射，開始時低到每只小鼠注射1000個CLDN6-CAR-T細胞，隨后在CLDN6-CAR-T細胞移植后不久接種或者不接種CLDN6-LPX。在不接種CLDN6-LPX的小鼠中，主要的CLDN6-CAR-T細胞定植與注射的細胞數量呈線性相關，而且隨著時間的推移保持穩定，或者緩慢下降。值得注意的是，在接種CLDN6-LPX的小鼠中，CLDN6-CAR-T細胞發生增殖，這種增殖與初始注射的細胞劑量無關。CLDN6-LPX介導的1000個CLDN6-CAR-T細胞的增殖導致外周血中存在可檢測到的CLDN6-CAR-T細胞水平。幾乎全部移植的CLDN6-CAR-T細胞群體經歷CLDN6-LPX介導的激活和增殖。相比于來自未接種CLDN6-LPX的小鼠的CLDN6-CAR-T細胞，來自接種CLDN6-LPX的小鼠的CLDN6-CAR-T細胞一旦與CLDN6陽性的腫瘤細胞共同培養時就會產生更高水平的IFNγ和表現出顯著更高的抗原依賴性的溶細胞活性。此外，接受低劑量CLDN6-CAR-T細胞移植的小鼠受益于重復接種CLDN6-LPX。在接受高劑量CLDN6-CAR-T細胞移植的小鼠中，CLDN6-CAR-T細胞在體內的增殖在達到較高水平后保持穩定。

為了評估CLDN6-LPX重復接種對CLDN6-CAR-T細胞長期持續存在的影響，接受CLDN6-CAR-T細胞移植的小鼠接種三次周劑量的CLDN6-LPX，隨后再進行兩次具有更長無治療間隔（treatment-free interval）---4周和4.5周---的CLDN6-LPX接種。首次CLDN6-LPX接種導致CLDN6-CAR-T細胞快速增殖超過了兩個數量級，隨后的每周接種維持較高水平的CLDN6-CAR-T細胞，從而導致它們在總外周血淋巴細胞中的比例超過了15%。

鑒于CAR-T細胞療法的最突出的嚴重不良事件是細胞因子釋放綜合征（CRS），這些研究人員探索了CLDN6-CAR-T細胞與CARVac策略聯合使用時全身性細胞因子釋放發生增加的可能性。他們分析了在接受CLDN6-CAR-T細胞移植的小鼠在接種CLDN6-LPX后的血清IFNγ、IL6和NFα水平。除了IFNγ在早期發生輕度的短暫升高之外，并未觀察到受測的促炎性細胞因子經歷較大的上升。此外，單次接種或重復接種CLDN6-LPX的小鼠的脾臟在結構上并未顯示出任何明顯的病理變化；在小鼠接受CLDN6-LPX重復接種后的不同時間點上，它們的脾臟的細胞組成在CD11c+樹突細胞和F4/80+巨噬細胞群體方面發生輕度的暫時性下降，而在T細胞、B細胞和NK細胞群體方面并未發生數量變化。

最后，在荷瘤小鼠中，它們在接受小鼠CLDN6-CAR-T細胞移植后，接受單次CLDN6-LPX或對照RNA-LPX接種。在未接種CLDN6-LPX的情形下，CLDN6-CAR-T細胞對腫瘤的控制是不完全的，而且腫瘤生長僅是受到延緩。相比之下，在10只接受CLDN6-CAR-T細胞和CLDN6-LPX聯合治療的小鼠中，有6只表現出對較大腫瘤的完全排斥，而且具有顯著更高的中位生存期。當對荷瘤小鼠進行CLDN18.2-CAR-T細胞和CLDN18.2-LPX聯合治療時，它們也實現了類似的治療結果。

接著，在攜帶CLDN6陽性OV90異種移植腫瘤的小鼠模型中，他們證實重復接種CLDN6-LPX可導致移植到這些小鼠體內的人CLDN6-CAR-T細胞發生特異性增殖。有效的腫瘤控制與CLDN6-CAR-T細胞在外周血中的較高比例相關聯，從而證實接種CLDN6-LPX可導致CLDN6-CAR-T細胞在體內發生高效增殖和更好地持續存在。在小鼠的異種移植腫瘤模型中，進行CLDN18.2-CAR-T細胞和CLDN18.2-LPX聯合治療也可實現類似的治療結果。

這些發現表明CARVac可用于改善CAR-T細胞的抗腫瘤作用。這就為利用CAR-T細胞治療難以治療的實體瘤提供了一種新的策略。然而，這些結果是在臨床前模型中實現的，它們是否在人體中也是如此，還有待開展進一步的研究加以驗證。（生物谷 世聯博研Bioexcellence） 

小編推薦會議  2020（第十一屆）細胞治療國際研討會
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