迄今為止，美國和歐盟已經相繼批準了兩種CAR-T細胞療法，分別是諾華與賓夕法尼亞大學合作開發的Kymriah?（CTL019），用于治療急性淋巴細胞白血病（ALL），以及 吉利德旗下公司Kite制藥開發的Yescarta?，用于治療治療復發或難治性彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）和原發性縱隔大B細胞淋巴瘤（PMBCL）成人患者。

盡管CAR-T的安全性和有效性已得到很好的驗證，然而，由于產品的異質性、制造復雜和缺乏標準化的全球監管，CAR-T仍然是局限于數百名患者的精品療法。

實現大規模CAR-T生產是提高其可及性的重要課題，為此，標準化各國的CAR-T制造和法規勢在必行且具有挑戰性。

近日，江南大學的戴曉峰教授和解放軍總醫院的韓為東教授作為共同通訊作者在Biotechnology Advances（SCI一區，IF=11.452）發表了一篇題為：“Standardizing CAR-T therapy: Getting it scaled up（標準化CAR-T療法：擴大規模）”的文章，圍繞限制CAR-T的生產規模的問題，回顧了當下的狀況和挑戰。

標準化CAR-T制造

基因工程T細胞的臨床制備首先需要采集患者外周血單個核細胞，對其進行增殖，然后進行基因修飾和擴增，并在輸注前進行篩選和/或冷凍保存。鑒于CAR-T生產原料的多樣性和現有的各種培養技術，修飾T細胞最終的質量變化仍然是一個有待解決的重要問題。

CAR-T細胞生產的經典工作流程（圖片來源：Biotechnology Advances）

戴曉峰教授和韓為東教授指出，以下7個因素的標準化對于大規模CAR-T生產的成功是決定性的：

    制造過程

    原料

    病毒載體

    輔助試劑

    質量控制

    治療后免疫監測

    政府監管

7個決定性因素（圖片來源：Biotechnology Advances）

制造過程

制造過程應該追求（1）生產安全且臨床上有效的細胞產品；（2）可擴展性，以便更多的患者可以從這些技術中受益而不犧牲產品的質量和可再生產性。

為了實現這一目標，文中倡議使用封閉式自動化系統和質量源于設計（quality-by-design，QbD）理念。

封閉式自動化系統

實施封閉的培養系統是一個防止產品污染和保持無菌環境的可靠策略。為此，可以將關鍵試劑的生產程序納入一個封閉系統，或者，建立良好的跟蹤供應鏈和技術，使原料生產能夠在封閉系統中完成。

從細胞制備、篩選、培養、擴展、轉導到配方，自動化在標準化生產過程中有著特殊的用途，目前已經有一些公司建立相應的技術平臺。

幾種CAR-T制造平臺的對比

（圖片來源：Biotechnology Advances）

- 中國生物技術公司博雅控股（BoyaLife）建立一個集臨床級細胞分離、純化、培養、洗滌和配方于一體的CAR-TXpress?平臺，這是一種緊湊的單元操作裝置。

- 德國美天旎生物（Miltenyi Biotec）自主研發的CliniMACS? Prodigy是一個集細胞分選、擴增、轉導、培養等多功能于一身的高度自動化臨床級別細胞制備平臺，提供一種由多個功能模塊組成的一體化系統。

但其使用受到一些缺點的限制，例如成本高，長時間細胞培養期間其他功能部分不可用，以及需要定制供應商設計軟件。

 瑞士CDMO巨頭Lonza與Octane Biotech合作開發自動生物反應器Co-coon?，這是一個由多個一體化單元組成的高通量系統，可以通過可定制規模的高通量方式并行處理源細胞，被稱為GMP-in-a-box系統。

QbD

QbD始于所需的產品質量屬性的描述，這直接確定了影響產品安全性和有效性的特征和相關參數，并為量化參數變異創造了設計空間。通過將科學知識和風險分析整合到制造過程的開發中，QbD可識別合適的操作信封（envelope），并且可通過知識的增加進行迭代修改，從而生產高質量的產品。

鑒于CAR-T產品的異質性和產品質量的不確定性，如何將細胞群的可測量分子和細胞特征與產品質量聯系起來，將決定CAR-T制造與QbD的成功與否。

原料

CAR-T的原料是高度可變的患者細胞，通常來自接受放化療的患者，這決定了細胞中可能包含不同水平的抑制因子或對刺激具有抗性的T細胞亞群。這些因素對確定制造過程的可重復性造成挑戰。

目前，兩種策略可以解決這一挑戰。首先，從T細胞中除去抑制元件。已經報道了通過幾種方法去除這些抑制元件后T細胞培養物的改善結果，例如：（1）通過同時使用兩種細胞表面標志物CD44和CD137分離抗腫瘤CD4 T細胞，耗盡抑制性調節性T細胞群（Treg細胞）；（2）使用涂有抗CD3和抗CD28的大磁珠與適用于袋子的大磁鐵，這代表了一種將隔離和刺激結合在一起的強大的制造工藝。

其次，起始原料使用定義的T細胞子集。特定的T細胞亞群，即記憶干細胞，被證明可以提供改善的臨床效果并被認為是良好的起始原料。例如，針對巨細胞病毒或Epstein-Barr病毒的內源性抗原反應性記憶T細胞已被用作基因工程的來源T細胞，因為具有抗原特異性的記憶T細胞有利于預防病原體，因為它們在淋巴細胞清除和CAR-T后防止病毒再激活方面具有良好的效果。

病毒載體

病毒載體用于將CAR轉導入T細胞的過程，被認為是美國CAR-T細胞制造過程的關鍵原料。與高度異質和個性化的血液樣本和CAR-T細胞終產品不同，病毒載體可以大量生產并在-80°C下穩定儲存4至9年。

通常，批量生產用于細胞療法的病毒載體的時間超過2周，其中大部分時間花費在產生足夠量的細胞上。細胞培養擴增數天至適當的數量，然后進行質粒轉染，生產病毒載體。病毒載體應該具有阻止它們重新獲得復制能力的特征。密碼子優化的Gag/Pol可最大限度地減少載體組分之間的同源性，自我滅活長末端重復序列，去除所有不必要的序列和輔助基因，這些都是用于預防這一問題的規范設計。

轉染后48小時內，表達CAR的病毒載體可從培養基中收獲，通過交換培養基可以收獲多批病毒載體。在過濾生產細胞和碎片后，病毒載體通過一系列下游處理進行純化，并使用儲存緩沖液進行富集。

載體質量包括無菌和純度（即缺乏包裝細胞）、效力、同一性和滴度，對于最終CAR-T產物的成功至關重要，為此，需要在受控條件下、在GMP設施中以最小的開放處理制造，以及隨后的一系列安全性測試以確保每批載體產品符合用于T細胞轉導之前的標準。

根據FDA指南，安全性測試涉及“細胞特性測試”，其通過一系列表型和/或生物化學檢測來評估細胞特性和異質性。“效能測試”評估CAR-T產品的功能；“活力測試”定量細胞活力；“無菌測試”驗證細胞沒有被外來物質污染，如細菌、真菌、支原體和病毒；“純度測試”確保產品不含殘留的宿主細胞和質粒DNA，并免除與工藝相關的雜質； “一般安全性測試”評估最終產品的臨床應用的安全性，以及隨后在給藥前應用于解凍冷凍細胞的“批次釋放測試”。

當細胞轉導中使用整合病毒載體時，需要進行檢查細胞和培養基中復制型逆轉錄病毒/慢病毒（RCRs/RCLs）是否存在的額外測試，以幫助確定最終CAR-T產品對患者輸液的安全性。細胞轉導的載體選擇和優化對于降低大規模CAR-T制造的最終產品的可變性和最大化效率至關重要。常用載體是基于γ逆轉錄病毒和慢病毒的復制缺陷型載體系統。慢病毒載體保留了感染非分裂細胞的能力，因此具有增加的轉導效率。第三代微小慢病毒載體由于其體積大大減小（由一組HIV基因構建）和安全性增強（在載體生產細胞之外無功能）而獲得進一步青睞。

當使用病毒載體時，應監測生產、收集和純化步驟，并提供有關提供載體的制造商的詳細信息。所有整合載體的一個潛在問題是通過將載體DNA整合到宿主細胞癌基因附近引起的插入誘變。在這方面，慢病毒載體優于γ逆轉錄病毒載體，因為它們的整合模式有利于遠離基因啟動子的位點。其他因素如編碼轉基因、啟動子、細胞類型和適應癥也與插入誘變相關。

如果載體產物中存在RCR/RCL，則可以增加致癌潛力。因此，在整個載體制造過程和載體修飾細胞產物的多個階段，需要進行RCR/RCL的嚴格測試。

FDA建議對使用病毒載體的細胞和基因治療進行長期安全性評估。例如，一項美國試驗已經在進行，對接受CTL019治療的患者進行15年隨訪（NCT02445222），其主要目標是監測與使用病毒載體相關的延遲不良事件。

非病毒載體

基于mRNA、DNA和轉座子/轉座酶的電穿孔系統已經顯示出能有效轉導T細胞的前景，這解決了有關病毒載體使用的一些問題，例如安全性問題、大規模制造和復雜的操作步驟。

當使用非病毒方法進行轉導時，應嚴格控制mRNA或DNA質粒的質量，試劑應為臨床級，并且電穿孔裝置應適用于臨床。

然而，非病毒轉座子系統可能需要長時間離體擴增以使CAR+ T細胞達到治療劑量，這在很大程度上限制了它們的臨床應用。目前，已經提出了幾個解決這個問題的方法。例如，非病毒睡美人（SB）轉座的CAR基因來自極小化DNA載體（即小環）而非傳統SB質粒可以顯著提高穩定的基因轉移率和細胞活力，以滿足臨床CAR+ T細胞對產量的要求。

輔助試劑

在離體操作過程中所使用的試劑，例如抗體、細胞因子、血清或固體支持物如珠子，其質量可能顯著影響CAR-T終產品的安全性、純度和效力。

所有試劑必須遵循USP <1043>關于輔助材料的建議。特別重要的是，鑒于制造過程的高度可變性，應限制使用天然來源的物質。例如，培養基應該是無血清的，以降低被牛海綿狀腦病（BSE）或病毒污染的風險，如果不可能的話，應該提供證實血清必要性的文件。同樣，推薦使用其他添加劑，如細胞因子和抗生素，以便去除。如果都不適用，那么它們應該被精確地化學定義，具有臨床等級，并且沒有內毒素和偶然污染。

這些添加的組件需要有效且穩定地協同工作以形成集成的試劑系統，理想的情況下，該制備系統使得制造過程足夠穩健，以生產患者來源的合格細胞產品。

質量控制

CAR-T產品的安全性、純度、特性和效力構成了其關鍵質量屬性。鑒于其高度異質性和復雜的制造程序，個體化療法對這些屬性的要求遠遠高于普通的醫藥產品。因此，CAR-T產品必須接受許多質量控制分析，以滿足所有發布的標準和良好生產規范（GMP）指南。

轉導效率

轉導效率（CAR陽性T細胞的百分比）是決定CAR-T細胞體內效應的重要參數。目前的指南要求通過流式細胞儀或等效途徑確定轉導效率，但沒有明確規定該參數的閾值。

理論上，通過將抗生素抗性基因摻入CAR載體，然后使用相應的抗生素選擇陽性細胞，來生產純CAR陽性T細胞是可行的。然而，由于其對CAR-T產品施加的復雜安全問題，不適用于臨床應用。

因此，仍然未確定細胞產品中是否存在最佳輸注的CAR-T細胞群，這需要科學界發現和制定可行的標準，以及政府當局發布控制轉導效率的相應指南。

生物學效力

CAR-T細胞的生物學效力需要在輸注前確定，常用指標是CAR-T細胞的裂解活性。免疫檢查點，如PD-1和CTLA-4，已經表明能抑制CAR-T細胞的效力，但未包含在指南中已確定的效力控制閾值。

由于離體和體內CAR-T效力之間存在差異，并且CAR-T細胞進行的修飾增加了釋放測試的復雜性，因此有必要制定標準方案來全面評估CAR-T細胞的體外生物學功能：確定改變CAR-T細胞生物學效力的分子的表達水平，并且建立公認的通用技術來控制CAR-T細胞的生物學效力。

毒性

毒性是CAR-T產品臨床應用的重要考慮因素。研究人員應提供全面而詳細的毒性評估標準，包括毒性等級分類（'on-target'，'on-target, o? tumor'，'o?-target'）和為每個等級制定精心設計的策略。

除了詳細說明質量控制中的毒性外，在進行CAR-T治療時，還應考慮患者護理，如制備免疫抑制藥物以預防細胞因子釋放綜合征的發生和其他嚴重的不良反應。

與傳統醫療產品相比，CAR-T細胞的質控過程在可用材料的數量和測試的時間點選擇方面有更多限制。由于這些產品在輸注或冷凍保存之前的保質期有限，因此還必須及時進行測試。

自動化

自動化有助于標準化質量控制方案（protocol）：

    自動染色、采集和分析過程將有益于培養細胞群的流式細胞儀分析，例如使用MACSQuant分析儀和分析工具；

    自動獲取和分析流量數據可以幫助快速生成標準化報告并顯著減少工作量，例如LIMS（實驗室信息和管理系統）；

    實施自動跟蹤和批量記錄，可以促進質量控制，其中有效的跟蹤需要涵蓋整個制造過程，即從開始材料采樣到患者輸注。在制程（in-process）和質量控制系統的緊密連接中，建立自動批量記錄是必要的，這允許在每個制造過程結束時推廣高度標準化的個性化方案，從而比較不同生產地點和不同流程的質量控制數據，促進我們對細胞產品的理解。

然而，盡管目前有許多選擇可以實現CAR-T（“制造過程”）的某些步驟的自動化，但是使整個過程自動化的設備相對較少。因此，為了創造最小化人為干預和易于使用的封閉環境，開發覆蓋整個生產過程的制造系統是必要且具有挑戰性的。此外，關于細胞樣品自動分析的監管協議能使自動化制程中的決策成為可能，從而實現細胞治療產品的自動化質量控制，但目前仍然缺乏。

總之，質量控制對CAR-T療法的成功至關重要，需要建立一個由公認的指導方針監管的標準化質量控制框架，并且開發盡可能少的外部干預的自動化設備，以幫助實現這一目標。

治療后免疫監測

與傳統的現成藥物不同，穩健監測過繼轉移后的CAR-T細胞對于其生物活性的闡明和改進至關重要。目前的監測重點是評估CAR-T細胞頻率和表型，內源性免疫反應的變化，炎癥細胞因子水平，腫瘤抗原表達和微環境。

CAR-T的大規模應用和患者隨訪涉及高通量和多重分析技術，包括TCR測序，基因表達平臺，多重質譜細胞計數方法和多通道微珠免疫測定。腫瘤PET成像等新興方法尚未應用于CAR-T細胞反應的評估，但或許能通過追蹤免疫細胞為CAR-T治療后患者反應的理解增添新的內容。

在全球范圍內，標準化和協調監測分析可以使結果在不同地點的機構、公司和醫院之間具有可比性，從而產生大量免疫監測信息，有助于推動CAR-T領域的進一步發展。

政府監管

迄今為止，全球已經注冊了近300項CAR-T臨床試驗（不包括試驗終止或撤銷），美國有107項試驗，中國有130項（根據www.clinicaltrials.gov）。鑒于獨特的功能和來源，任何傳統的'off-the-shelf（現成）'藥物都無法代表CAR-T產品。無論是基因還是細胞療法，都必須遵循它們的任何指導方針和行政管理規范，特別是發布的關于CAR-T細胞文件。

美國

在美國，FDA將CAR-T細胞分類為351種生物產品，并通過“Considerations for the design of early-phase clinical trials of cellular and gene therapy products”和“Guidance for industry: preclinical assessment of investigational cellular and gene therapy products”對其進行監管。

此外，CAR-T產品應遵循指南“Guidance for FDA reviewers and sponsors: content and review of chemistry, manufacturing and control (CMC) information for human somatic cell therapy investigational new drug applications (INDs)”和“Guidance for FDA reviewers and sponsors: content and review of chemistry, manufacturing and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drug appli- cations (INDs)”，其中詳細說明CAR-T細胞的制造、過程控制、釋放測試和質量控制。

為了加速醫療產品開發并向需要它們的患者提供更有效的治療，美國政府于2016年12月發布了“21世紀治愈法案（21st Century Cures Act）”，以簡化藥物和設備審批流程，并更快地提供臨床治療，美國政府已在9年內授權5億美元用于幫助FDA實施該法律。在此基礎上，建立了新的加速產品開發計劃，包括“再生醫學高級治療（RMAT）”和“突破性醫療器械項目”，該計劃為符合涵蓋范圍的生物制品或設備（包括CAR-T和CAR-T相關設備）提供了新的加急選擇。

歐洲

在歐洲，醫療管理由歐洲藥品管理局（EMA）監管，適用于CAR-T產品監管的指南是2012年最終確定的“Guideline on quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modi?ed cells”，它定義了科學原理，為開發和評估含有經授權的人類使用的基因修飾細胞的醫藥產品提供指導，重點放在細胞產品的質量、安全性和有效性上。此外，CAR-T細胞的制造應遵循先進治療藥品（第1394/2007號）的規定以及基因轉移醫藥產品的質量、臨床前和臨床方面的指導（CPMP/BWP/3088/99）。

與FDA發布的指導原則不同，EMA有專門的文件來規范作為醫療產品的基因修飾細胞。

中國

標準化和自動化制造代表了具有更高安全性、更便宜的產品，因此在發展中國家實施CAR-T產品的規范性規定尤其有利且具有實際意義，因為它們通常較少設有自動化的“個體化車間”。

在我國，有助于規范CAR-T產品臨床研究的第一個指南是國家衛計委于1993年發布的《人的體細胞治療及基因治療臨床研究質控要點》。

后來，國家食品藥品監督管理總局（NMPA）發布了一系列基因和細胞療法的監管準則。2003年，NMPA發布了《人基因治療研究和制劑質量控制技術指導原則》，其中定義了臨床試驗中考慮的醫療產品的基本要求，并將遺傳修飾的細胞和攜帶功能基因的載體指定為醫療產品。NMPA在同一年發布的另一條適用于CAR-T產品的指南是《人體細胞治療研究和制劑質量控制技術指導原則》。

此外，CAR-T產品還受到應用于臨床試驗的藥物通用指南的監管，即由NMPA于2003年8月發布的《臨床試驗用藥物生產質量管理規范》。監管干細胞臨床試驗的指南 ，即“限制臨床應用醫療技術”，由國家衛計委于2015年發布。NMPA于2017年12月22日發布了《細胞治療產品研究與評價指導原則》（試行，第216號，2017年）。

盡管已經發布不少法規，但為了安全性的考慮，CAR-T細胞還有一些獨特的特征需要受到監管，而目前我國的任何監管指南都沒有涵蓋這些特征，如轉導效率，預計CAR-T細胞的行政文件規范將在不久的將來發布。

為整個CAR-T行業制定廣為接受的指南具有挑戰性，因為具有不同表型或生產方法的CAR-T細胞通常會產生相同的效果。因此，良好的指導方針應保證CAR-T產品的安全性和有效性，使其制造透明化和標準化，并描述生產、制程釋放測試和認證分析的最低和基本標準。

另一方面，一些決定CAR-T產品的效率和安全性的因素，如果沒有作為政府指導原則發布，則需要作為建議發布，以幫助保證和改善CAR-T產品的質量。例如，預處理，通常涉及去除抑制抗腫瘤活性的各種抑制因子的非清髓性化學治療方案，這應該需要考慮在未來的指南更新中加入。其他因素，如修飾T細胞的活力、表型、無菌、同質性和遺傳穩定性，以及每個細胞的基因拷貝數也可以在指南作出建議。

目前，部分國家已發布了CAR-T細胞臨床試驗的國內指南，并且不同國家的監管部門之間進行交換是很常見的，例如在FDA和EMA之間以及FDA和CFDA之間的。

為了實現全球范圍的臨床試驗，各國的監管指南需要實現協調。全球藥品監管機構的九名成員，包括FDA、EMA、加拿大衛生部、巴西ANVISA、印度國家生物制品研究所（INB）、日本衛生福利和勞工/制藥和醫療器械局、韓國食品藥品安全部、新加坡衛生科學局（HSA）和Swissmedic已召集組建論壇，討論細胞或基因治療監管的最佳監管方案（https://www.i-p-r-f.org/en/working-groups/gene- therapy-workinggroup/）。在制定統一的法規之前，CAR-T產品開發中依舊存在很大的不確定性，這在很大程度上取決于監管機構的主觀判斷。

（生物谷Bioon.com）

小編推薦會議 2019（第十屆）細胞治療國際研討會

http://meeting.bioon.com/2019cell-therapies？__token=liaodefeng