2017年是細胞免疫治療領域的豐收年。來自Novartis的Kymriah和來自Kite Pharma（Gilead收購）的Yescarta相繼獲得FDA批準在美上市。中國方面，復星醫藥牽手Kite Pharma設立合資公司復星凱特，旨在將Kite Pharma的KTE-C19產品技術引進中國。其他國內上市公司如安科生物、佐力藥業、冠昊生物等均以不同形式參與CAR-T治療的市場化推進。

同時，藥品醫療器械審評審批制度改革深化的大背景下，細胞治療行業的申報標準也越來越清晰。中國藥審的核心機構藥品審評中心（CDE）也在積極籌備細胞免疫治療產品的審核工作。

然而，不可否認的是，CAR-T治療面臨著制備過程復雜、價格昂貴等生產問題，以及在血液癌癥中一定的復發率，和在實體瘤中效果有限等應用問題。對此，研發客專訪了賓夕法尼亞大學細胞免疫治療中心(Center for Cellular Immunotherapies)T細胞工程實驗室 (T Cell Engineering Laboratory；TCEL)主任趙陽兵教授。

趙陽兵教授畢業于重慶第三軍醫大學，獲得醫學和免疫學博士學位。在腫瘤免疫治療領域有超過20年的工作經驗，并在CAR-T和TCR-T領域有多項重磅級研究成果。同時，他還擔任賓夕法尼亞大學Perelman醫學院病理和實驗醫學學院Associate Professor。

CAR-T治療實體瘤

研發客：CAR-T技術目前在實體瘤中的嘗試不是很成功，您覺得原因在哪里？

趙陽兵：目前CAR-T技術在實體瘤上確實處于瓶頸期。其中主要的原因包括三個方面。

一是沒有安全的腫瘤特異性抗原靶，因此一般治療病人的CAR-T細胞劑量太低，無法看到真正療效；二是由于大多數實體腫瘤的異質性，很難有病人身上的所有（或絕大多數）腫瘤細胞都表達同一個靶，不像血液系統的腫瘤靶，如CD19、BCMA、CD123等。三是很多腫瘤的腫瘤微環境抑制機制很強，有時T細胞根本就到不了腫瘤部位，即使到了腫瘤部位其功能也可能會很快被抑制，甚至會變成腫瘤的幫兇。

研發客：最近有一些報道里提到腫瘤內注射，腫瘤內注射CAR-T細胞是否可行？

趙陽兵：關于腫瘤瘤內注射的話題，我認為對腦腫瘤以外的其他腫瘤，尤其是有轉移的腫瘤意義不大。由于腦腫瘤很少發生遠端轉移，局部注射還是可取的治療手段。但其他種類的腫瘤，一旦轉移會有非常多的轉移病灶，這種情況下很難再進行瘤內注射。目前T細胞免疫治療主要用于晚期轉移腫瘤病人，瘤內單純注射CAR-T細胞真正用于治療實際意義非常有限。因此，這種方法只能作為臨床研究，探索T細胞對于腫瘤的抑制功能。另外，如果CAR-T聯合其他療法使用，比如瘤內注射CAR-T和DC細胞，很可能CAR-T細胞殺死腫瘤細胞后可以釋放腫瘤抗原，這些抗原可以被注射的DC細胞俘獲，從而產生局部免疫反應和聯合效應。

研發客：您覺得CAR-T技術治療實體瘤的突破口在哪里？

趙陽兵：在我看來，CAR-T技術治療實體瘤突破口需要解決上面的三大問題：首先尋找安全的靶，在不安全的靶上加開關意義不大，在相對安全的靶，甚至安全的靶上加開關倒是很有意義。其次，靶向多靶點很有必要，可以有效防止腫瘤的免疫逃避。最后，CAR-T的聯合治療是讓CAR-T真正有效的重要途徑，也許是唯一途徑。聯合的方案很多，包括對T細胞的進一步修飾，如加PD1-CD28 轉換受體、CRISPR敲除PD1等。也可以是聯合其他抗腫瘤藥，如免疫檢查點抗體。也可以是聯合腫瘤疫苗，比如RNA疫苗、DC疫苗等。也許需要綜合這些所有的措施。這些都需要很多的研發工作和臨床試驗來驗證，需要大家的努力。

通用型CAR-T離產業化有多遠

研發客：我們知道您的實驗室已經成功開發了通用型CAR-T并在臨床前模型中得到驗證。我們是否有一天能做成通用的CAR-T產品，從而降低生產時間和成本？

趙陽兵：2013年CRISPR技術一出來，我們就開始嘗試使用這項技術制備通用型CAR-T。2014年我們就實驗成功并申請了專利。2016年作為人類首例CRISPR基因編輯技術的臨床試驗通過了RAC 審批。通用型CAR-T產品的制備已經不存在技術問題。但是很可惜由于其他的原因，我們沒能及時把通用CD19CAR-T用于臨床。目前，我們將CRISPR技術應用到NY-ESO-1TCR-T這個項目。這個項目主要是在T細胞中敲除內源性TCR和PD-1，轉入靶向NY-ESO-1的TCR到T細胞內。這個項目的臨床試驗申請剛剛獲得了美國FDA批準，這也是美國第一個使用CRISPR基因編輯技術的臨床試驗，將于年底開展臨床試驗。

但這個項目并不是所謂的通用型CAR-T。通用型CAR-T進展最快的是Cellectis公司。根據他們已經發表的數據，初步臨床試驗結果不如預料的好。我們理想的通用型CAR-T是同時敲除TCR和HLA-I，這樣保證輸注的異體T細胞既不會殺傷宿主也不會被宿主很快排斥。

但是我認為通用型CAR-T還是有很多問題尚待解決。

研發客：通用型CAR-T的難點在哪里？

趙陽兵：首先，一般通用型CAR-T是在敲除TCR后，對T細胞進行CD3的負性篩選。目前的篩選方法，篩選效率比較高，可以達到99%的純度。即使是這樣，也不能保證剩余的極少量的CD3陽性細胞不產生移植物抗宿主反應（GVHD）。因為這些細胞是轉了CAR的，在體內還可能會擴增導致殺傷作用的放大。因此，如果要應用通用型CAR-T，就要權衡輸入細胞的數量與療效。輸入的總細胞越少，里面包含的CD3陽性細胞越少，就越安全，但是療效可能會受到影響。我們不希望看到的是GVHD的發生，因為一旦發生就會有很大的臨床安全隱患。另外，使用通用型CAR-T的臨床方案設計也很重要。

其次，讓異體CART達到自體CART的效果可能還需要一段時間。主要解決的問題首先是異體排斥的問題。雖然通用型CAR-T進行了一些基因改造，但是不能保證一定不會被宿主排斥掉。我們知道對于CAR-T來講，T細胞的持久性（persistence）對于臨床療效非常重要。首先，如果敲除了HLA-I，第一個擔心就是NK細胞的清除。但是如果不敲除HLA-I，則會被宿主的免疫系統很快清除掉。哪種更不容易被清除掉，可能真正到了臨床試驗階段來進行對比，才能給出結論。其實在一些研究中，敲除了HLA-I的異體細胞可以再轉一個排斥較小的特殊的HLA-E。這樣的話就不會被NK細胞清除了。當然，這里面策略很多。我們在以前的文章中也描述的很詳細了。

另外，T細胞產品的產量和質量也會是通用型CART產業化要考慮的重要問題之一。我們都希望找到通用型CAR-T合適的細胞供體。理想的供體是越“年輕的”T細胞越好。目前已經有很多策略，比如使用干細胞、ips等。還有優化T細胞激活的策略，包括使用不同的細胞因子等。在這方面我們實驗室也有很多研究工作。在治療實體腫瘤上，這可能成為瓶頸，因為實體瘤CAR-T用量大，一個供者的T細胞量也許只夠治療一個病人，這樣的話其實成本比用自體還要高。

TCR-T技術的難點和瓶頸

研發客：我們知道您實驗室很大一部分工作是在研究TCR-T。與CAR-T相比，TCR-T在治療實體腫瘤的應用前景如何？

趙陽兵：與CAR-T相比，TCR-T 的優點是可以靶向被MHC提呈的細胞內的抗原。因此，在靶點選擇上具有天然優勢。我們知道有一類蛋白叫做Cancer testis antigen，這類蛋白一般在胚胎發育早期表達，胚胎發育完成后就只在具有免疫屏障的睪丸內表達。而在腫瘤細胞內，這些蛋白會重新表達。因此以這類蛋白為靶點的TCR-T會更加安全。這其中NY-ESO-1就是一個典型代表。而且NY-ESO-1 TCR最早是我在NIH開展研究的。根據目前的臨床試驗結果，NY-ESO-1 TCR-T的臨床效果和安全性都比較好。在MultipleMyeloma和Synovial sarcoma等，總體有效率可以達到30%-50%。針對Multiple Myeloma效果尤其好。用TCR-T的主要局限性是受到抗原提呈的HLA種類限制。另外，很多腫瘤可以通過很多途徑降低HLA表達從而逃避TCR-T的攻擊。

研發客：TCR-T技術的難點和瓶頸在哪里？

趙陽兵：TCR-T也有一些尚待解決的問題。首先是大多數天然篩選到的TCR一般活性較弱。通過基因突變的方法可以提高TCR的親和力和活性，但是，根據目前的數據和我們的經驗，大多數高親和力的TCR特異性會明顯下降，從而導致其靶向性下降而產生嚴重的臨床毒性。其次，腫瘤細胞通過下調HLA表達等的逃逸機制也會限制TCR-T的臨床效果。除此之外，腫瘤抑制性微環境也是TCR-T要解決的問題之一。CAR-T也好，TCR-T也好，如果要應用于實體瘤，都要解決實體瘤抑制性微環境的問題。

我們實驗室主要采用的方法是敲除內源性TCR、敲除PD-1等，敲除內源性TCR可以增加轉基因TCR的親和力，而敲除PD-1可以降低腫瘤免疫微環境的抑制。另外一點，也是我們實驗長期在做的，就是使用PD1-CD28 switch-receptor等融合分子。這類分子可以將腫瘤微環境抑制性信號轉換為激活性的信號。我們已經在動物模型中發現，加了switch-receptor的T細胞在腫瘤微環境內擴增更好，活性更高。當然，這是在動物模型中的結果，我們很期待在臨床試驗中看到效果。

我們實驗室主要是通過修飾T細胞的方法來促進其療效。很多其他的研究，比如用TCR-T與PD-1抗體聯用，或者與其他免疫調節分子，比如IDO抑制劑聯用等等，這些聯合治療的臨床結果也非常值得期待。

與泰斗同行

趙教授與細胞免疫治療領域泰斗級專家Steven Rosenberg教授和Carl June教授并肩工作數年。作為免疫治療領域轉化探索的先行者，趙教授與CarlJune教授一起主導創立了Tmunity Therapeutics公司，為細胞免疫治療產品從實驗室到臨床試驗再到市場鋪平道路。

研發客：您和細胞免疫治療先驅Carl June教授和Steven Rosenberg教授都有數年的合作經歷。能否簡單評價一下兩位教授？

趙陽兵：Rosenberg教授是基因治療和腫瘤細胞免疫治療的先驅， 是他第一個把轉基因T細胞用于病人。他一直是腫瘤T細胞免疫治療的領導者，從早期的LAK（Lymphokineactivated killer cells）細胞、TIL（Tumorinfiltrating lymphocytes）、CAR-T、 TCR-T到新抗原T，他都是第一個做臨床試驗的。他可以被稱為腫瘤T細胞免疫治療領域的鼻祖或祖師爺。他不僅開創了這個領域，而且一直帶領著這個領域，后勁十足。談到他個人，他是一個不圖名利而為科學獻身的真正的科學家。他可以說桃李滿天下。他的很多學生都在學術界或商界很有成就，而他在NCI擔任外科主任三十多年如一日，專心研究，不為名利。無論交談還是做報告，簡明扼要通俗易懂，個人魅力十足。

Carl June教授免疫學功底扎實，對T細胞共刺激分子的研究，尤其是CD28，有突出的貢獻。他也有很多個第一，比如：第一個用CAR-T 細胞治療病人（HIV感染病人）；第一個用慢病毒載體改造的細胞治療病人；第一個用基因編輯技術(ZFN) 治療HIV病人；第一個用RNA電轉T細胞治療病人；第一個被批準使用CRISPR技術治療病人；第一個讓CAR-T商品化。如果說是Rosenberg教授開創了T細胞免疫治療領域，那么是 June教授促成了T細胞免疫治療的產業化。

人物簡介

趙陽兵教授1996年作為訪問學者在以色列魏茨曼科學研究所（Weizmann Institute of Science）從事基因工程T細胞誘導骨髓移植免疫耐受的研究。2000年，他來到美國杜克大學醫學中心，開展RNA介導的腫瘤DC疫苗研究。2003年，他加入細胞免疫治療先驅Steven Rosenberg實驗室。在NIH工作的五年時間里，他主導研發了靶向腫瘤抗原NY-ESO-1的TCR和靶向Her2/Neu的三代CAR，并把這兩項突出成果推進到臨床階段。此外，他還開發了靶向CD19和VEGFR等的TCR-T和CAR-T治療技術，推動了相關臨床試驗的進行。

2009年，受另一位細胞免疫治療先驅CarlJune教授邀請，趙教授來到賓夕法尼亞大學轉化醫學研究中心，建立了T細胞工程實驗室，專心研究如何改造自體和制備異體的安全有效的T 細胞用于腫瘤免疫治療，開創性地將CRISPR/CAS9技術應用于TCR-T 和CAR-T領域。2016年6月，他領導的人類首例CRISPR臨床試驗全票通過了NIH Recombinant DNA Advisory Committee (RAC)審批，并于2017年12月通過了FDA的IND 申請（詳情見https：//www.nature.com/news/first-crispr-clinical-trial-gets-green-light-from-us-panel-1.20137）。

趙教授與來自美國、德國、以色列和中國等的多個頂級研究單位開展國際合作。也一直關注中國細胞免疫治療領域的發展，多次在中國舉辦的國際學術會議中做報告，介紹分享成功經驗，助推中國細胞免疫治療領域的發展。

目前，趙教授的實驗室以實際應用為導向，以解決臨床需求為目標，在細胞免疫治療領域有非常多的新技術和新療法在不斷被開發出來。其中針對前列腺癌、胃癌、肝癌、間皮瘤、胰腺癌、乳腺癌和神經膠質瘤等多種實體瘤的細胞免疫治療都已經進入關鍵臨床試驗階段。

代表性文章及解讀

1. Multiplex Genome Editing to Generate Universal CAR T Cells Resistantto PD1 Inhibition. Ren J， Liu X， Fang C， Jiang S， June CH， Zhao Y. Clin CancerRes. 2017 May 1；23(9)：2255-2266.

運用CRISPR基因編輯技術成功制備Universal CAR-T和敲除免疫檢查點PD-1的CAR-T細胞。該工作是賓夕法尼亞大學開展的全美首個CRISPR臨床試驗的基石。

2. A Chimeric Switch-Receptor Targeting PD1 Augments the Efficacy ofSecond-Generation CAR T Cells in Advanced Solid Tumors. Liu X， Ranganathan R，Jiang S， Fang C， Sun J， Kim S， Newick K， Lo A， June CH， Zhao Y， Moon EK.

Cancer Res. 2016 Mar 15；76(6)：1578-90.

包含PD-1膜外區和CD28膜內區的嵌合抗原受體成功幫助CAR-T細胞突破抑制性腫瘤微環境，大大增加了CAR-T細胞對腫瘤的殺傷效果。

3. Affinity-Tuned ErbB2 or EGFR Chimeric Antigen Receptor T Cells Exhibitan Increased Therapeutic Index against Tumors in Mice. Liu X， Jiang S， Fang C，Yang S， Olalere D， Pequignot EC， Cogdill AP， Li N， Ramones M， Granda B， Zhou L，Loew A， Young RM， June CH， Zhao Y. Cancer Res. 2015 Sep 1；75(17)：3596-607.

親和力優化的ErbB2和EGFR CAR-T可以特異性識別腫瘤細胞，避免了對正常組織細胞的殺傷。

4. Multiple injections of electroporated autologous T cells expressing achimeric antigen receptor mediate regression of human disseminated tumor. ZhaoY， Moon E， Carpenito C， Paulos CM， Liu X， Brennan AL， Chew A， Carroll RG，Scholler J， Levine BL， Albelda SM， June CH. Cancer Res. 2010 Nov 15；70(22)：9053-61.

電轉CAR-T細胞的應用

5. A herceptin-based chimeric antigen receptor with modified signalingdomains leads to enhanced survival of transduced T lymphocytes and antitumoractivity.

Zhao Y， Wang QJ， Yang S， Kochenderfer JN， Zheng Z， Zhong X， Sadelain M，Eshhar Z， Rosenberg SA， Morgan RA. J Immunol. 2009 Nov 1；183(9)：5563-74.

全球首個由Herceptin改造的抗HER2 三代CAR-T。

6. Construction and preclinical evaluation of an anti-CD19 chimericantigen receptor. Kochenderfer JN， Feldman SA， Zhao Y， Xu H， Black MA， MorganRA， Wilson WH， Rosenberg SA. J Immunother. 2009 Sep；32(7)：689-702.

Rosengberg實驗室使用的抗CD19CAR-T的臨床前研究成果。該研究為以后的臨床試驗奠定基礎，也是KitePharma已上市產品Yescarta的原型。

7. Primary human lymphocytes transduced with NY-ESO-1 antigen-specificTCR genes recognize and kill diverse human tumor cell lines. Zhao Y， Zheng Z，Robbins PF， Khong HT， Rosenberg SA， Morgan RA.

J Immunol. 2005 Apr 1；174(7)：4415-23.

全球最早的NY-ESO-1 TCR-T的發現和臨床前研究。

代表性專利

1、WO2004016803    Method of enhancing CD4+ T cell responses

2、WO2013126726    DOUBLE TRANSGENIC T CELLS COMPRISING A CARAND A TCR AND THEIR METHODS OF USE

3、WO2013126720    COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE ASSESSMENTOF TARGET CANCER CELL RESISTANCE TO CAR ENGINEERED T CELL KILLING

4、WO2013126712    Compositions and Methods for Generating aPersisting Population of T Cells Useful for the Treatment of Cancer

5、WO2013126733 A1   USE OF ICOS-BASED CARS TO ENHANCE ANTITUMORACTIVITY AND CAR PERSISTENCE

6、WO2013040557    RNA ENGINEERED T CELLS FOR THE TREATMENT OFCANCER

7、WO2013019615    SWITCH COSTIMULATORY RECEPTORS

8、WO2014011988 A3    Enhancing Activity of CAR T Cells byCo-Introducing a Bispecific Antibody

9、WO2014011993 A2   EPITOPE SPREADING ASSOCIATED WITH CAR T-CELLS

10、WO2015142675 A2   TREATMENT OF CANCER USING CHIMERIC ANTIGENRECEPTOR

11、WO2015112626 A8   Enhanced antigen presenting ability of car tcells by co-introduction of costimulatory molecules

12、WO2016070061 A1   Methods and compositions for modified t cells

13、WO2016069282A1     Altering gene expression in cart cells anduses thereof

14、WO2016069993 A1   Compositions and methods of stimulating andexpanding t cells

15、WO2016122738A1     Compositions and methods for t celldelivery of therapeutic molecules

(世聯博研(Bioexcellence)世聯博研Bioexcellence）