圖片來源：www.phys.org

為了闡明特殊基因錯誤如何引發疾病，科學家們需要在細胞中進行實驗來研究具體突變對細胞的影響，如今來自洛克菲勒大學（Rockefeller University）和紐約干細胞研究所等機構的研究人員通過研究，利用基于CRISPR的基因編輯技術成功在細胞中重現了疾病發生的過程，相關研究刊登于國際著名雜志Nature上。

研究者Marc Tessier-Lavigne說道，這種新型技術可以幫助科學家們直接精確地將引發疾病發生的基因植入細胞中，從而獲取細胞模型來進行更為深入的研究，這就為后期開發一系列人類疾病的新型療法提供了新的希望，比如治療阿爾茲海默氏癥等。

過去很多年里，科學家們設計了很多種方法來模擬在實驗室培養的細胞中模擬疾病的發生過程，當科學家們盡力想讓細胞轉變成為特殊人類疾病模型時，他們就通過切割基因組中的DNA并且換上替代品來進行研究。隨著CRISPR-Cas9系統的發現，科學家們開始利用基于該系統的基因編輯技術來開發出患病的細胞模型。

文章中研究人員Dominik Paquet及其同事首次嘗試利用CRISPR-Cas9技術在細胞中插入兩種遺傳突變，而這兩種遺傳突變和引發阿爾茲海默氏癥疾病的β淀粉樣蛋白的產生直接相關，隨后研究者發現，這種方法的成功率較低，僅有一小部分細胞會攜帶上理想的基因突變。主要的問題就是CRISPR-Cas9可以持續切割細胞的DNA，而細胞的自身修復細胞會不斷修復每一個切割處直到細胞產生一種可以抑制切割的錯誤，而這種錯誤一旦產生就會在細胞中不斷產生很多新型未知的問題。

隨后科學家們評估了另外一種方法，即引入大塊的突變來抑制后期的切割現象，通過在CRISPR-Cas9靶向檢測的DNA不同部位中引入大塊突變后，研究者發現這可以明顯減少意外錯誤產生的數量。當研究人員利用CRISPR-Cas9引入阿爾茲海默氏癥的任意一種遺傳突變后，他們仔細觀察遺傳序列后發現了一種特殊的模式，也就是說在CRISPR-Cas9切割位點和研究者引入受體細胞的突變之間存在一段序列上的距離。

隨后研究者Kwart說道，序列距離較短會產生出更易于包含兩種突變的細胞，而隨著距離增加，編輯的成功率就會降低，而一種突變的比率和其原始基因版本的峰值之間的距離就會開始拉大；更為重要的是研究者發現了特殊的距離關系，這樣他們就有可能制造出大量的雜合細胞；而利用上述技術研究人員就可以對干細胞的基因組進行編輯使細胞包含兩種阿爾茲海默氏癥基因中的任意一種，隨后誘導這些干細胞轉化成為神經元細胞并且產生大量β淀粉樣蛋白，從而模擬阿爾茲海默氏癥的疾病表現。

此前并沒有簡單的方法來控制確定是否通過CRISPR-Cas9技術編輯就可以產生和特殊疾病表現相關的雜合突變，而本文研究中，研究者通過對上述距離關系特性的分析就成功實現了利用基于CRISPR的技術在細胞中重現疾病癥狀的目的。（世聯博研(Bioexcellence)世聯博研Bioexcellence）

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doi:10.1038/nature17664
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Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9

Dominik Paquet, Dylan Kwart, Antonia Chen, Andrew Sproul, Samson Jacob, Shaun Teo, Kimberly Moore Olsen, Andrew Gregg, Scott Noggle & Marc Tessier-Lavigne

The bacterial CRISPR/Cas9 system allows sequence-specific gene editing in many organisms and holds promise as a tool to generate models of human diseases, for example, in human pluripotent stem cells1, 2. CRISPR/Cas9 introduces targeted double-stranded breaks (DSBs) with high efficiency, which are typically repaired by non-homologous end-joining (NHEJ) resulting in nonspecific insertions, deletions or other mutations (indels)2. DSBs may also be repaired by homology-directed repair (HDR)1, 2 using a DNA repair template, such as an introduced single-stranded oligo DNA nucleotide (ssODN), allowing knock-in of specific mutations3. Although CRISPR/Cas9 is used extensively to engineer gene knockouts through NHEJ, editing by HDR remains inefficient3, 4, 5, 6, 7, 8 and can be corrupted by additional indels9, preventing its widespread use for modelling genetic disorders through introducing disease-associated mutations. Furthermore, targeted mutational knock-in at single alleles to model diseases caused by heterozygous mutations has not been reported. Here we describe a CRISPR/Cas9-based genome-editing framework that allows selective introduction of mono- and bi-allelic sequence changes with high efficiency and accuracy. We show that HDR accuracy is increased dramatically by incorporating silent CRISPR/Cas-blocking mutations along with pathogenic mutations, and establish a method termed ‘CORRECT’ for scarless genome editing. By characterizing and exploiting a stereotyped inverse relationship between a mutation’s incorporation rate and its distance to the DSB, we achieve predictable control of zygosity. Homozygous introduction requires a guide RNA targeting close to the intended mutation, whereas heterozygous introduction can be accomplished by distance-dependent suboptimal mutation incorporation or by use of mixed repair templates. Using this approach, we generated human induced pluripotent stem cells with heterozygous and homozygous dominant early onset Alzheimer’s disease-causing mutations in amyloid precursor protein (APPSwe)10 and presenilin 1 (PSEN1M146V)11 and derived cortical neurons, which displayed genotype-dependent disease-associated phenotypes. Our findings enable efficient introduction of specific sequence changes with CRISPR/Cas9, facilitating study of human disease.