膽管癌（CCA）是惡性度較高的消化系統腫瘤。因其發展隱蔽且臨床癥狀及體征出現晚，故給早期診斷帶來困難。原發性硬化性膽管炎（PSC）是導致膽管癌的主要原因之一。在非侵染時期，鑒定肝內的膽管癌及肝癌（HCC）是非常困難的。目前尚未有準確區分CCA，PSC，及HCC的生物標記物。

為了尋找新的生物標志物，來自西班牙的研究者，利用高效的外泌體分離方法，分別從CCA、PSC，和HCC患者的血清樣本中分離得到外泌體，運用蛋白質組學技術從中篩選出新的生物標記物，具有作為臨床診斷工具的潛在應用價值，研究結果發表在國際著名期刊Hepatology上。

關鍵詞：膽管癌，膽管炎，肝癌，biomarker，診斷

2研究思路

3研究速讀

1、血清EV樣本的選擇、分離與鑒定

為了研究三者之間的區別，研究者選擇了43例膽管癌，30例膽管炎，29例肝癌患者與32例正常人的血清樣本，從中分離出細胞外囊泡(EV)作為研究對象。

通過使用納米粒子跟蹤分析（NTA）、圓形形態（透射電子顯微鏡）、大小（NTA為？180nm直徑）和標記物（免疫印跡檢測CD9、CD63和CD81）表明，大多數血清EV是外泌體。

2、外泌體蛋白質組學分析鑒定樣本間差異

研究者運用蛋白質組學分析鑒定病理樣本中的差異表達蛋白，在健康人外泌體鑒定到541個蛋白，膽管炎外泌體鑒定到427個蛋白，膽管癌外泌體鑒定到574個蛋白，肝癌樣本中鑒定到399個蛋白，然后對這些蛋白進行韋恩圖分析，并且進行兩兩比較（圖1）。

通過分析發現膽管癌中VNN1， CRP（C-reactive protein）， FIBG， IGHA1， A1AG1 and GGT1 這6個蛋白的表達量顯著高于其他的三個樣本，免疫印跡驗證表明膽管癌樣本中CRP顯著性高表達，說明CRP蛋白顯示出較高的診斷價值。

3、比較正常細胞和CCA細胞分泌的EV中蛋白組成差異

為了研究膽管癌細胞與正常細胞間的差異，研究者培養正常的膽管細胞、SV40侵染的無限增殖H69細胞與兩種商品化的膽管癌細胞EGI1 、TFK1，分離出細胞外泌體，并對其形態及抗原特征進行對比分析。結果表明，4種樣本的外泌體在形態及大小上沒有顯著的區別，免疫熒光分析發現兩種膽管癌腫瘤細胞中CD63的量顯著的高于正常細胞。

然后作者進一步的對四種樣本進行蛋白質組學分析。發現兩種腫瘤細胞的蛋白差異不顯著，與H69細胞和正常細胞均存在有顯著性的差異，并且H69細胞蛋白比正常細胞更接近于腫瘤細胞。對差異蛋白的生物信息學分析發現，多部分差異蛋白與腫瘤發生發展密切相關，參與細胞增殖，炎癥，細胞生存，分化，遷移等生物學功能。

4、異種移植CCA，證實含有差異蛋白的外泌體能夠在血清中釋放

最后研究者在免疫缺陷小鼠的肝臟中原位植入人CCA細胞，證實了膽管癌CCA細胞外泌體中的差異蛋白能夠在血液中鑒定到。為此研究者將膽管癌細胞注射到免疫缺陷小鼠體內，通過蛋白質組學分析小鼠血液外泌體，從中鑒定到23個人類的蛋白，證明腫瘤的外泌體可以分泌到血液中。說明血清EV中發現的新型蛋白質組學特征，具有作為診斷工具的潛在應用價值。

4小結

本研究通過對比膽管癌（CCA），原發性硬化膽管炎（PSC），及肝癌（HCC）的血清外泌體的蛋白差異，發現樣本間的蛋白質組學特征。通過對人膽管癌細胞EV的蛋白質組學分析顯示，與正常人膽管細胞釋放的EV相比，其致癌蛋白的豐度更高。在免疫缺陷小鼠的肝臟中原位植入人CCA細胞，導致含有類似人致癌蛋白的EV在血清中釋放。在CCA、PSC和HCC患者的血清EV中發現的新型蛋白質生物標志物，具有作為診斷工具的潛在應用價值。(世聯博研(Bioexcellence)bioon.com）

小編推薦會議  2019（第四屆）外泌體與疾病研討會

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