一、外泌體的歷史

20世紀80年代初研究人員在體外培養的正常細胞或者腫瘤細胞發現細胞外泌現象，細胞向其培養基中分泌帶有細胞膜特征的囊泡結構。1983年Johnstone等發現體外培養的綿羊網格紅細胞在成熟過程中會向外分泌含有鐵轉運蛋白受體(transferrin receptor)的小囊泡結構，他們將細胞釋放的這種小囊泡結構命名為外泌體(圖2)。

早期發現分泌外泌體的細胞主要是一些造血類細胞系，如B細胞，T細胞，樹狀突細胞，肥大細胞，血小板等。隨著研究深入，許多非造血類細胞也大量產生外泌體，如腫瘤細胞，表皮細胞及神經細胞等。

供體細胞分泌的外泌體可直接被同組織內其周圍的受體細胞吸收；同時外泌體也可進入到體液循環中，如血液，唾液，尿液，腦脊髓液等，通過體液運輸被不同組織內受體細胞吸收，實現組織間物質交流(圖3)。

二、外泌體形成及功能

外泌體并不能簡單理解為細胞直接向外界環境分泌的囊泡結構，其形成過程有著復雜的調控。主要可分為三個階段，細胞膜內陷形成胞內體，胞內體多囊泡化和多囊泡體與質膜融合釋放外泌體。

真核細胞內吞形成初級胞內體(early endosome)，在高爾基體等膜細胞器和胞內體蛋白分選轉運裝置(ESCRT)等蛋白的調控下成熟，為次級胞內體(late endosome)。次級胞內體自身外膜常內陷形成許多小囊泡結構，使次級胞內體中常含有許多囊泡，故又稱為多囊泡體(multivesicular bodies，MVB)。其中一些MVB直接與細胞內溶酶體(lysomsome)融合并降解；一些MVB運往高爾基體進行回收；而還有一些MVB與質膜融合向細胞外釋放小囊泡，即外泌體(圖4)。細胞分泌外泌體是受細胞精確調控的，其中包括一系列蛋白(ESCRT，Rab等)的參與調節，細胞內(鈣離子濃度，氨基酸濃度等)與細胞外(pH等)環境的影響。

外泌體是具有生物活性的囊泡膜結構，內含有脂質體，蛋白質，RNA和miRNA等物質。不僅可以被周圍的細胞吸收，也可以進入體液循環中被不同的組織細胞吸收，實現細胞間的物質和信息傳遞，參與對受體細胞基因表達水平的調控，最終影響受體細胞的生理功能。

外泌體參與許多生物學功能，包括免疫調控，B淋巴細胞釋放攜抗原呈遞蛋白的外泌體可誘導T淋巴細胞免疫應答；導致一些疾病的形成與發展，神經退行性疾病阿茲海默癥等；促進病毒感染與傳播，如HIV病毒可通過外泌體尋找最適細胞進行感染及傳播；此外，在癌癥中外泌體也扮演著重要的角色，本文將對外泌體與癌癥的關系及其在癌癥檢測與治療中的應用進行全面的介紹。

三、外泌體--癌癥的發生及惡化中扮演著重要的角色

1981年已發現體外培養的癌細胞有外泌現象，之后在許多癌細胞中都發現外泌體的釋放，如卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌，結直腸癌等(圖5)。不僅如此，癌細胞往往對外釋放高于正常細胞的外泌體，卵巢癌患者血液中EpCAM陽性外泌體的含量要顯著高于正常人和卵巢良性疾病患者。癌細胞分泌大量外泌體可能是由于某些原癌基因或者抑癌基因的突變易使外泌體生成或分泌增加；同時癌細胞周圍低pH微環境也可誘導其大量分泌外泌體。

癌細胞分泌的外泌體在癌癥的發生及惡化過程中起著重要作用。外泌體可促進癌細胞的增殖，擴散及幫助癌細胞逃離來自體內自身或者體外的清除機制(圖6)：

1、外泌體促進癌細胞的增殖

癌細胞通過分泌外泌體，將細胞內的致癌因子(蛋白，核酸等)轉運到受體細胞，可促進受體細胞增殖及癌變。乳腺癌分泌的含有HER2原癌蛋白的外泌體，卵巢癌分泌的含有miR-21外泌體，可激活受體細胞原癌基因，抑制其抑癌基因，促進癌細胞的增殖。

癌細胞可向外釋放帶有細胞凋亡因子(caspase-3等)的外泌體，降低自身細胞凋亡活性；同時也向外釋放含有抑制凋亡的因子(survivin等)的外泌體，進入受體細胞，降低受體細胞凋亡活性，促進癌細胞的增殖。

癌細胞通過分泌攜帶血管生成因子(Del-1，miR-210等)的外泌體，被癌變組織附近內皮細胞吸收，促進癌變組織內新血管的形成，為腫瘤的生長提供更多的營養。

2、外泌體能夠幫助癌細胞逃離免疫系統或者藥物的清除

癌細胞分泌的外泌體能夠抑制對癌細胞的免疫應答，既可以通過激活骨髓來源的抑制性細胞(MDSC)抑制T細胞免疫應答，也可以通過破壞腫瘤抗原呈遞過程來降低細胞的免疫應答；同時外泌體還能夠誘導免疫細胞凋亡，如前列腺癌外泌體中的Fas配體誘導T淋巴細胞凋亡。因此，外泌體能夠降低免疫系統活性，幫助癌細胞逃離免疫清除。

此外，有研究發現在藥物治療癌癥過程中，癌細胞可分泌外泌體將藥物從細胞內轉運到細胞外，以減少藥物對細胞的毒性(黑色素瘤cisplatin治療過程)；同時也發現獲得抗藥性的癌細胞可分泌攜帶有抗藥因子的外泌體，被其它癌細胞吸收后，可產生抗藥性。因此，外泌體又能夠幫助癌細胞逃離藥物的清除。

3、外泌體常為癌細胞的擴散創造有利的微環境

我們可以用“種子與土壤”來做個類比，癌細胞為“種子”，癌細胞生長的微環境為“土壤”。癌細胞分泌的外泌體不僅在組織內部為癌癥的生長創造合適的微環境，還可以通過體液進入不同的組織，建立有利于癌細胞生長的微環境，為癌細胞的擴散形成有利條件。最為常見的是癌細胞向淋巴結擴散時，會向淋巴結中分泌大量外泌體，為癌細胞在淋巴結的生長創造合適的微環境。

外泌體如同癌癥的一把“利劍”，能夠促進癌細胞不斷增殖，幫助癌細胞逃離免疫或藥物的清除，為癌癥的擴散創造合適的微環境，在癌癥的發生及惡化過程中扮演著重要的角色。

但是，這是一把“雙刃劍”，在利于癌癥發生的同時，暴露了癌癥的存在，成為癌癥診斷的有效手段；外泌體與癌癥的密切聯系，也為有效治療癌癥提供了新的策略。

四、外泌體--癌癥診斷中的應用

如我們所知，外泌體是細胞向外分泌的小囊泡，因此，外泌體具有供體細胞的物質組成特征，具有一定的細胞特異性。在對癌癥患者體內外泌體的大量研究中發現，癌細胞分泌的外泌體中有可用于區別其它細胞外泌體的特征性分子，可以作為癌癥診斷的分子標志物。目前，常見的可應用于癌癥診斷的外泌體中分子檢測標志物主要包括兩類：蛋白質和核酸。

1、外泌體蛋白質標志物可用于癌癥診斷

基于大量研究結果表明，癌癥患者體內的外泌體中一般會富集兩類蛋白質分子，一類是在癌細胞中高表達的蛋白質，如原癌蛋白；一類是被癌細胞特異地向外外分泌的蛋白質，如抑癌蛋白。異于正常外泌體的特點，使外泌體中的這些蛋白質分子可以作為癌癥診斷的標志物。目前許多外泌體蛋白質標志物被發現可用于癌癥的診斷，包括癌癥的早期診斷，預后復發風險評估(表1)。

外泌體蛋白質標志物可用于癌癥的早期診斷。癌癥發現的越早，治愈的機率越大，預后5年生存率更高。外泌體蛋白質標志物檢測可應用于許多癌癥的早期診斷，如Fibronectin，EDIL3用于乳腺癌早期診斷；卵巢癌早期診斷標志物Claudin-4；Survivin可用于前列腺癌的早期診斷(圖7)。

外泌體蛋白質標志物檢測也可作為很好的預后復發風險評估手段。胰腺癌中發現外泌體蛋白Glypican-1既可以用于癌癥早期診斷，也是很好的預后檢測手段；非小細胞肺癌患者中的外泌體蛋白NY-ESO-1標志物可用于評估患者預后5年生存率。

外泌體蛋白質標志物檢測提高了癌癥診斷的精準性。前列腺癌診斷中，外泌體Survivin蛋白標志物檢測比傳統血液PSA蛋白檢測更精確；卵巢癌診斷中，外泌體蛋白標志物Claudin-4比傳統的CA125蛋白檢測準確度更高。

外泌體多蛋白標志物結合使用，可顯著提高癌癥診斷的精準性。Sorensen等在肺癌檢測中利用外泌體中多蛋白標志物(CD151，CD171，TSPAN8)，發現可獲得更為準確的癌癥診斷結果。

2、外泌體核酸標志物可用于癌癥診斷

外泌體中蛋白質的存在伴隨著外泌體的發現即被驗證，像鐵轉運蛋白等(圖2)。但直到20多年后Valadi等于2007年在小鼠和人的肥大細胞外泌體中首次發現RNA和miRNA的存在，并具有生物活性，可以被受體細胞吸收，影響受體細胞的表達。1年后Taylor等發現外泌體miRNA可用于癌癥診斷標志物。他們從卵巢癌患者與未患癌的血清中分離獲得的EpCAM陽性外泌體，通過分析外泌體中miRNA含量差異，發現8個miRNA可作為卵巢癌各時期診斷標志物，開啟了核酸標志物在癌癥診斷的應用(圖8)。

之后大量外泌體miRNA被發現，可作為癌癥診斷檢測的標志物。結直腸癌外泌體中的7個miRNA可作為各時期結直腸癌的診斷標志物；外泌體中的miR-21，miR-1246可作為乳腺癌檢測的標志物。除此以外，卵巢癌，前列腺癌，胰腺癌，非小細胞肺癌等癌癥中，都發現可以作為癌癥診斷的外泌體miRNA標志物(表2)。

外泌體miRNA標志物檢測可作為癌癥預后復發風險評估手段。外泌體miR-19a可作為結直腸癌低治愈率評估，研究發現外泌體中miR-19a含量高的結直腸癌患者易發生肝轉移，預后復發率高，5年生存率低。而miR-4772-3p能作為結直腸癌2期和3期在FOLFOX化療后的復發評估標志物，外泌體中miR-4772-3p含量低的結直腸癌患者，在FOLFOX化療后復發率高，生存率低。

除了miRNA類標志物，外泌體中其他的核酸分子也發現可作為癌癥診斷的標志物。Manterola等發現來源于血清的外泌體中小的非編碼RNA分子RNU6-1可應用于診斷多形性成膠質細胞瘤；Nilsson等發現來源于尿液的外泌體中的PCA-3，TMPRSS2：ERG轉錄RNA分子是潛在的前列腺癌診斷標志物；Melo等發現GPC陽性外泌體中帶有KRAS突變的DNA分子可用于胰腺癌的診斷及個性化治療。

3、外泌體“液態活檢”在癌癥診斷中的應用

細胞分泌的外泌體可直接從各種體液中，血液，尿液，唾液，腹水，胸腔積水等中獲取，且癌癥患者體液中往往含有大量的外泌體，為外泌體液態活檢應用于癌癥診斷提供了物質基礎；大量研究結果表明多種癌癥可利用外泌體中的蛋白質或核酸標志物進行診斷，如乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，結直腸癌等，為外泌體液態活檢應用于癌癥診斷提供了理論基礎；外泌體可以直接從各種體液中大量的純化獲得，純化及鑒定技術日趨完善，為外泌體液態活檢應用于癌癥診斷提供了技術基礎(附3)。

外泌體液態活檢應用于癌癥診斷的優勢可總結為三點：樣本易取，穩定性好，覆蓋癌癥異質性。

外泌體液態活檢相較于組織活檢，無創取樣，取樣便捷。伴隨著外泌體純化及鑒定技術的提升，使得其易從血液和尿液中大量獲得，對樣本的需求量也變小(附3)。

外泌體液態活檢穩定性優勢主要體現在兩方面：一方面是外泌體能夠維持內部分子標志物穩定性。外泌體可以很好的保護內部核酸或蛋白質不被體液中的各種酶降解，Valadi等發現外泌體內RNA分子不會被外部環境的RNase降解。另一方面外泌體在長時間的體外儲存樣本中依然穩定存在，活性維持的很好。Taylor等發現4度存放24hr的血液樣本中的外泌體miRNA標志物仍然可用于卵巢癌檢測。從-80度儲存兩年樣本中獲取的外泌體，依然有著較好的穩定性。

外泌體液態活檢相比于傳統的組織活檢，覆蓋了癌癥的異質性，反映癌癥的全貌。癌癥異質性是癌癥發生及轉移的基礎，也是癌癥診斷和治療的障礙。傳統組織活檢受限于取樣，不能完全覆蓋癌癥的異質性，尤其對癌癥晚期或轉移的患者，而外泌體液態活檢可很好的覆蓋癌癥的異質性。同時在癌癥治療過程中，外泌體分子標志物可隨著治療發生變化，因此，外泌體液態活檢又可以對病人進行動態監控。

從癌癥患者體液中大量獲取的外泌體，通過蛋白質或核酸標志物檢測，可用于癌癥診斷及預后復發評估，顯著提高了液態活檢在癌癥診斷中的應用(圖9)。目前外泌體液態活檢已經逐步開始應用于癌癥的診斷中，如2016年Exosome Diagnostics公司推出ExoDx Lung(ALK)檢測產品，有效地應用于非小細胞癌診斷中，未來將會有越來越多的外泌體液態活檢產品應用于各種癌癥的診斷中。

五、外泌體--癌癥治療中的應用

外泌體不僅可以為癌癥診斷提供分子檢測標志物，還可用于癌癥治療中。目前外泌體癌癥應用中研究較多的是作為癌癥治療的工具，當然也發現外泌體可直接作為癌癥治療的靶向(圖10)。

1、外泌體可作為癌癥治療的工具

外泌體作為癌癥免疫治療的工具。目前較為成熟的研究是從癌癥患者中分離樹狀突細胞的外泌體(DEX)，然后進行體外抗原多肽(MAGE)的引入，再將改造的外泌體重新導入患者體內，可激活體內的免疫系統，從而促進對癌癥細胞的免疫清除。該技術初步應用于一些癌癥患者的治療，如黑素瘤，非小細胞肺癌等。

外泌體可作為癌癥治療藥物的載體，可承載各種類型的藥物，包括核酸，蛋白質，脂類物質或其它小分子化學物。外泌體可通過血液等體液運輸與傳遞，被癌細胞吸收，實現藥物對癌癥的靶向治療；外泌體是細胞自身分泌物，相比于目前常用的脂質體和聚合納米微顆粒，不易引起免疫排斥反應，毒副性小，穩定性好；外泌體能夠維持內部藥物穩定性，尤其是對核酸或蛋白類藥物；外泌體可以提高疏水類藥物的溶解性，增加藥物在體液中的含量，提高藥物被癌變組織吸收的效率。此外，外泌體作為藥物載體，能夠促進不易被體液藥物直接靶向的組織有效地吸收藥物，比如腦，外泌體可提高藥物從血液向腦組織內的吸收，有效地治療腦部的癌變。

2、外泌體可能作為癌癥治療的直接靶點

大量研究發現，外泌體直接參與癌癥的發生與惡化，其中包括攜帶致癌因子(原癌蛋白，RNA等)導致受體細胞癌變，癌細胞的轉移與擴散；同時外泌體可抑制免疫細胞的活性(免疫細胞凋亡等)，使得癌細胞可以逃離免疫系統清除。

因此，Aethlon Medical研發了一套裝置Hemopurifier？，可特異性地清除癌細胞來源的外泌體，解除其對免疫系統的抑制，從而實現對癌癥的治療。而有些研究直接將外泌體作為藥物的靶向，比如抑制外泌體的合成與分泌，如amiloride；阻礙外泌體被受體細胞吸收，如diannexin。但是目前發現的靶向外泌體治療存在獲益患者少，毒副作用不太清楚等問題，仍然需要更多地研究。

總之，外泌體作為癌癥的治療策略現在仍在研究中，需要克服的一些應用中的問題：如高純度的外泌體獲取依然存在技術局限與成本高的問題；外泌體治療過程中是否會有副作用也無法完全確定；能否體外合成外泌體用于癌癥治療仍需更多對外泌體結構的全面認識。當然，外泌體作為癌癥的治療工具已經有了初步的臨床醫學進展，在未來外泌體的應用可能成為治療癌癥的有效手段。

六、小結

外泌體像一把“雙刃劍”，與癌癥有著密切的聯系。外泌體既可以促進癌細胞的不斷增殖與擴散，對癌癥的發生及惡化有著重要的作用；而同時外泌體又可以應用于癌癥的診斷與治療，外泌體液態活檢提高了癌癥診斷的便利性，精確性，外泌體實現細胞間物質運輸的特征被應用于癌癥的治療中。當然，目前外泌體在癌癥診斷與治療中的應用尚處于初級階段，未來仍需要對外泌體有更深入的認識，使其能更好地應用于醫療，提高癌癥患者的生存率。

外泌體(exosomes)與微囊泡(microvesicles)都是細胞向外分泌的囊泡狀膜結構，但是在結構組成和生物學功能上兩者還是不同的。主要區別可以總結為三點：

一是大小和形狀不同；外泌體較小，30-120nm左右，大小形態均一；而微囊泡一般較大，50-100

二是產生機制不同；外泌體的產生需要細胞膜內陷，與胞內體融合，形成MVB，然后在與質膜融合釋放。而微囊泡一般指直接是細胞外排囊泡結構。同樣都有質膜特點，但是外泌體膜還具有胞內體膜特征；

三是膜包裹物質不同；由于產生機制的區別，所以外泌體內物質與胞內體有關，而微囊泡一般不具備。

但是，外泌體與微囊泡在許多研究中，并沒有作很好的區分，甚至不作區分(稱為胞外囊泡Extracellular vesicles EV)；一是受限于純化技術，很難徹底地將外泌體與小的微囊泡(低于100nm)分開；二是缺乏統一的標準，即使針對外泌體的大小范圍，不同的研究人選取的標準也不盡相同。故上述僅為現在普遍接受的一個區分標準，隨著研究的深入與技術的革新，今后可能會對細胞各種囊泡結構有了更為精確地認識。(生物谷世聯博研Bioexcellence）

小編推薦會議  2019（第四屆）外泌體與疾病研討會

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