王永明教授從2010-2013年在斯坦福大學醫學院從事博士后研究,于2013年9月回國組建實驗室,所以較早地開展了技術改進的研究。CRISPR/Cas9技術主要面臨兩個核心問題,一個是如何避免脫靶,另外一個是如何提高編輯效率。在此之前,他曾試圖利用ZFN技術和TALEN技術的優勢對CRSPR的特異性進行改造,但是由于學生剛進實驗室,沒有任何實驗技能,進展非常緩慢,不久就看到有兩個實驗室搶先發表了文章。
于是王永明教授實驗室轉向研究提高編輯效率,王永明教授說:“在編輯細胞系的時候,人們都用質粒瞬時轉染細胞,編輯效率受轉染效率和編輯時間的限制。如果用病毒載體編輯細胞,可以長期表達Cas9和gRNA,但是病毒會整合到基因組中,不利于后期實驗。我們就想到了用附著體載體(episomal vector)表達Cas9和gRNA。同時在載體上表達嘌呤霉素抗性基因,通過藥物篩選去除不含有質粒細胞,轉染效率低的細胞也可以實現高效的編輯。如果去除篩選藥物,質粒會很快的從細胞中丟失,細胞中不再含有外源基因,在干細胞中最高可以實現100%的編輯。”
附著體載體就是在普通質粒上加了一段病毒來源的序列,使得質粒能夠在真核細胞中復制,就像普通質粒在細菌中復制一樣,這樣就可以長時間表達Cas9和gRNA,延長編輯時間。同時,他們實驗室還發明了高通量的測試gRNA活性的方法,一次可以測試數萬個,覆蓋人的所有基因,這個工作完成后,會極大的方便這個領域的人進行基因編輯。
王永明教授不僅只單單關注CRISPR這一種技術,16年韓春雨發現了號稱“第四代基因編輯工具NgAgo”,最初文章報道說NgAgo能夠利用磷酸化的單鏈DNA引導進行基因編輯,于是王永明教授和南通大學的劉東課題組利用NgAgo編輯斑馬魚,發現只能敲低基因的表達,不能編輯,也就是說不能改變DNA序列。雖然,他們當時對NgAgo的敲低原理還不清楚,但后來韓國的一個課題組發現NgAgo能夠靶向切斷RNA,這部分的解釋了其敲低基因表達的原理。對于NgAgo是否能像CRISPR1一樣成為強大的基因編輯工具,王永明教授認為“利用NgAgo做基因編輯的前景不太樂觀,主要原因是體外生化實驗證明它沒有DNA酶切割活性。”
CRISPR久經科學家的考驗,它的發明成功為基因治療帶來極大的便利,王永明教授對基因治療的研究也十分感興趣,目前正在研究利用CRISPR-Cas9技術治療由于TUBB8基因突變造成的不孕不育癥和治療肥厚型心肌病、長QT綜合征的可行性。
據王永明教授介紹基因治療方式可以分為兩種,一種是將細胞從體內分離出來,在體外進行突變糾正,然后再輸回體內。比如HIV病毒通過CCR5受體入侵T細胞,科學家把T細胞分離出來,利用CRISPR-Cas9技術將CCR5基因敲除,這樣T細胞就不會被HIV病毒侵染了。另外一種治療方式是將CRISPR-Cas9系統直接導入體內治療疾病。比如杜氏肌營養不良是由于DMD基因突變造成的,如果將突變的外顯子用CRISPR-Cas9技術敲除,基因功能會得到部分的改善,從而達到治療目的。雖然這些前景看起來十分樂觀,但是CRISPR-Cas9技術可能會造成脫靶修飾,帶來難以預料的風險。王永明教授表示目前這種應用只限于科學研究,應用到臨床還有很長的路要走。
尊敬的 先生/女士
您已注冊成功,注冊信息及注意事項已發到聯系人及參會人郵箱,請注意查收。如未收到,請聯系大會聯系人。