近兩年，ctDNA液態活檢在腫瘤診療中的成績可謂有目共睹，歷次學術大會上專家都給予了的充分的肯定。但另一方面也表達了對液態活檢的期望：ctDNA優勢不少，但是復雜的變異情況，加之高昂的檢測費用。使得研究階段提出的療效評價，病情監測等應該充分發揮液態活檢取樣優勢的方面，卻離臨床應用總有一步之遙。

腫瘤液態活檢的概念亦起源于CTC，相比ctDNA，發現最早卻浮沉多年的CTC在幾番打磨后逐漸發揮出自己的優勢。CTC可是祖師爺級別的發現，與孟德爾種豌豆得出遺傳定律大概是一個時期的事情。早在1869年，CTC在血液涂片中就已經被觀察到了，但是是在癌癥病人死后尸檢時觀察到了CTC的存在。講基因組學的故事常常從孟德爾說起，而這篇文獻但凡是想介紹下CTC歷史的文章中必被小輩拱手引用。這時間可比隨著醫學的發展與進步，人類給癌癥摘掉絕癥的帽子早了一百多年。

隨著CTC分離和鑒定技術的發展，對于CTC的研究再次成為腫瘤領域的焦點。FDA批準上市了cellsearch掀起了新一輪的熱潮；有人對PubMed下circulation tumor cell 這一關鍵詞檢索發現2013-2015年間全球每周新文獻數量在20-25篇左右。今天就帶大家一起走進這個大熱點。

基礎篇

CTC從哪里來

循環腫瘤細胞（Circulating Tumor Cells，CTC） 主要來源于腫瘤組織自發脫落的腫瘤細胞或是人為操作帶入外周血的腫瘤細胞。

CTC在脫離了腫瘤組織的環境后往往很脆弱，失去細胞間相互作用而發生失巢凋亡，被血液中的免疫細胞攻擊致死，或者干脆覺得進了循環系統就像貓咪跳進洗衣機，被血流的剪切力給沖死了。

但是如果CTC發生了上皮間質轉化，或者是形成循環腫瘤細胞團（circulating tumor microemboli，CTM） 組團外出，那么存活下來并且發生轉移的概率則大大增加。

CTC與轉移

腫瘤轉移的機制尚有許多不清之處，有待驗證，但是近年來CTC的研究揭示了CTC是惡性腫瘤患者出現術后原位復發、遠端轉移和浸潤的重要原因。上皮間質轉化則可看做是“種子-土壤”假說的現代版本。

“種子-土壤”這個名字一出，相信大家已經理解的八九不離十了。原發腫瘤組織產生“種子”，“種子”找到合適的土壤生長為新的腫瘤組織。目前研究發現上皮間質轉化就是產生種子的關鍵一步。

上皮間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition， EMT） ，顧名思義就是上皮細胞在形態學上發生向間充質細胞表型轉變的過程。這一過程本是胚胎發育的基本過程，也是炎癥反應、傷口愈合等組織修復再生時必須的。然而腫瘤細胞在一定條件下發生EMT轉化就會得到新技能：遷移。

上皮細胞間連接緊密，相對穩定不可移動。間質細胞很少有細胞連接，結構松散分散于細胞外基質中。這一轉化是受到嚴格調控的過程，基因表達的改變促使上皮細胞停止分裂，離開原本附著的基底膜，切斷與周圍細胞的聯系，細胞骨架也發生相應的變化以增強運動能力。

CTC與病程

轉移是腫瘤發展進程中的重要特征，CTC的數量與腫瘤負荷、病程發展息息相關。

這是一項針對乳腺癌病人的研究中的案例。虛線表示了影像學的評估，PD代表疾病進展，PR代表部分緩解，SD表示疾病穩定，這一評價體系是NCI、FDA等全球多家癌癥研究機構推薦的實體瘤療效評價標準。主要通過影像學方法評估瘤體大小的變化評價療效。可以明顯看到在第一個疾病緩解期，CTC水平已經上升，換藥后，CTC的下降也即時反應了藥物有的有效性。

據有關研究發現，CTC對于病情進展的指示作用要比影像學評估平均早6-8個月的時間，可以幫助醫生及時掌握病情，調整治療方案。

技術篇

在開始正題前，我要講一個警匪的故事，如果你能勉強接受這個不完備的假設，或許對于理解CTC的技術有一點點幫助。

人體的內部仿佛其實很像一座城池，循環系統就是承載它運轉的交通系統，里面跑著的紅細胞像運輸員，數量極為龐大；白細胞像治安官負責抓壞蛋。城市總有黑暗面，而腫瘤就是黑社會，黑惡勢力的暗自成長就會影響城市正常的功能，掠奪城市運轉的社會資源。黑社會一方面會擴張自己的領地，而那些小弟里面也有不甘心于此，妄圖自立山頭。

現在復習一下之前的內容，循環系統里面會有一些小流氓是出來閑逛的，他們比較容易被警察捕獲或是其他原因掛掉。另外一些小流氓或許內心已經悄悄變化，長出了一顆王者的心，他們比較耐磋磨，條件適宜的情況下，可以另辟疆土自立門戶。有一些干脆組團出發，抵御循環系統惡劣的環境。

CTC的富集

轉移是腫瘤發展進程中的重要特征，CTC的數量與腫瘤負荷、病程發展息息相關。只是觀測到CTC并不能作為有效的預后標準，科學的評價必須建立在CTC有效富集的基礎上。CTC這種細胞計數即能反映預后的標志物，富集方法對于檢測有效性的影響可想而知。然而CTC沉浸在血細胞的海洋里，CTC含量之低有如在文學巨著里面挑錯別字。那么我們是如何解決這個問題的呢？

方法1，生物富集

負責運輸的紅細胞與CTC和白細胞的個頭差別比較大，分離起來不成問題。主要的難點集中在白細胞與CTC的分離上。

正向富集——正面出擊，我們直接尋找到小流氓

黑惡團伙總會帶一些別人不帶著的東西，比如舉著個棒子。我們用特異性尋找棒子的方法來找到CTC細胞。

最常用的棒子就是EpCAM，通過EpCAM富集是一項成熟的技術，cellsearch系統也是通過它對細胞進行分選的。

EpCAM全稱上皮細胞粘附分子，是細胞膜上的一種蛋白質，正常情況下在多數上皮組織上都有所表達。而在造血系統來源的細胞、腦組織和血管內皮細胞中沒有明顯的EpCAM的表達，是一種特異性很好的分選方法。

負向富集——排除法，去掉不是壞人的人，剩下的就是壞人

流氓帶著棍棒，當然治安官也會有一些特點比如隨身攜帶專用電臺，所以只要我們能把帶手臺的治安官找到，剩下的就是我們要找的CTC啦。白細胞是雖然種類繁多，但是有一點是一致的，他們都表達CD45。

CD45是一種白細胞共同抗原，是細胞之間溝通信號傳導上有關鍵作用，在幾乎所有的白細胞上都有表達。警察們互相聯系的手臺要保持一致嘛。

方法2，物理富集

運輸員警察和小流氓的個頭不一樣、密度不一樣、帶的電荷不一樣、或者流體中運動狀態不一樣，這些物理性質也幫助我們分選出CTC。但是這些物理方法主要針對單個的CTC，聚成團的CTC有可能在分離過程中因為物理性質與單個細胞不同而無法篩選出來。

方法3，結合著用

先負向負極去除絕大多數白細胞，再進行正向富集，可以大大提高正向富集的效率。

物理富集和生物富集結合著用，改造生物富集的物理條件也可以提高效率。

在EpCAM以外增加其他的捕獲靶標分子，也可以減少因為EMT造成的CTC細胞丟失。

CTC的檢測

1. 計數

對富集到的細胞進行鑒定、計數是最常規的手段。

目前的鑒定手段也是非常多的，常用的有通過細胞染色體變異來判斷（FISH），或是通過細胞表面抗原免疫熒光來判斷。

但是一旦落實到計數層面就會有一個小的問題，我們之前說過如果CTC是個小流氓的話，它的危害程度并不完全一致。有些難成氣候，在循環系統中存活較短，不會四處興風作浪。然而另一些則懷揣開疆僻壤之心，自立門戶，危害極大。

單純的通過腫瘤細胞的一些特性只是鑒定了腫瘤細胞，而將這兩類細胞一概而論，或許并不是一個理想的選擇。

2.q-PCR

撬開CTC的外殼，發現他們真實的狀態，或許是一種有效的方式。

研究發現，CTC在表達上皮細胞基因的同時，表達類似干細胞及上皮間質轉化的基因，這些基因的表達對腫瘤患者的預后評估有更為精準的臨床意義。

在對轉移性結直腸癌患者的研究中發現，高水平表達CK20或高水平表達Survivin的患者的總生存期分別是9個月和10個月，與CK20和Survivin表達水平都低的患者總生存期（33.2個月）相比，總生存期明顯下降。

CTC-CK20或CTC-survivin其中任一個標記物在轉移性結直腸癌患者中的表達水平的高低都是對其總生存期最強的預測因子，而對于二者的綜合評價，會對患者的預后有更全面的評估。

細胞角蛋白CK家族是上皮性腫瘤較特異的免疫組化標志物，CK19和CK20是腫瘤組織免疫組化中常用的標志物。survivin是細胞凋亡的抑制分子，因其有利于細胞存活而得名“存活素”，正常情況下僅在胚胎和發育中的胎兒組織中出現，終末分化的成人組織中一般沒有表達。

然而上皮間質轉化這一與復發轉移風險高度相關的過程，會使細胞部分丟失或全部丟失上皮細胞的特征。因此這一過程通路上重要基因的表達結合干細胞標志物ALDH1也是我們評估復發轉移風險的指征。

高靈敏度的qPCR加上合理選擇的marker基因，是對CTC細胞的精細刻畫。讓我們不只是清點數量，而是在一眾舉棒子的小流氓中可以判斷他們的搞事情的能力到底有多高。

CTC檢測的應用

何時應該進行CTC檢測呢，其實在治療的任何時期都可以切入，對病程達到動態監測的目的。其中最具直觀檢測意義的還是在與療效評估，術前術后或化藥/靶藥用藥前后，無論療效評估還是復發風險判斷，對于患者的治療都是非常重要的。

癌癥治療手段日益豐富，已被視為慢性病的當下，CTC就是癌癥慢病管理的重要手段，從細胞層面了解腫瘤發生發展情況，早于影像學評估及時調整治療方案，幫助患者爭取時間盡早調整治療方案，才能有更好的帶瘤生存。